Ensaio de Co-Infiltração para Triagem de Efetores de Patógenos que Suprimem o Silêncio do RNA Vegetal

Pegue uma mistura contendo volumes iguais de duas suspensões de Agrobacterium tumefaciens , cada uma carregando um plasmídeo — um codificando GFP e o outro codificando uma proteína efetora.

Perfure um buraco e use uma seringa sem agulha para infiltrar a mistura na superfície inferior das folhas saudáveis e totalmente expandidas de Nicotiana benthamiana 16c.

Apague qualquer excesso de suspensão com tecido mole para evitar o crescimento bacteriano excessivo.

Marque as áreas infiltradas e incube as plantas em condições ideais de crescimento.

O Agrobacterium transfere os DNAs plasmídicos para as células vegetais, onde os genes GFP e efetores são transcritos em mRNAs e traduzidos em proteínas.

O sistema de defesa da planta utiliza silenciamento de RNA, onde siRNAs duplex são carregados no RISC. A fita passageira é removida, e a fita guia direciona o complexo para degradar o mRNA da GFP alvo.

No entanto, as proteínas efetoras se ligam aos siRNAs, impedindo sua associação com o RISC e permitindo que a fluorescência da GFP persista.

Isso permite a identificação de efetores de patógenos que suprimem o silenciamento de RNA vegetal.

Misture volumes iguais de uma cultura de Agrobacterium contendo a pr