Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 2:12 min. • January 30th, 2026
Pegue uma mistura contendo volumes iguais de duas suspensões de Agrobacterium tumefaciens , cada uma carregando um plasmídeo — um codificando GFP e o outro codificando uma proteína efetora.
Perfure um buraco e use uma seringa sem agulha para infiltrar a mistura na superfície inferior das folhas saudáveis e totalmente expandidas de Nicotiana benthamiana 16c.
Apague qualquer excesso de suspensão com tecido mole para evitar o crescimento bacteriano excessivo.
Marque as áreas infiltradas e incube as plantas em condições ideais de crescimento.
O Agrobacterium transfere os DNAs plasmídicos para as células vegetais, onde os genes GFP e efetores são transcritos em mRNAs e traduzidos em proteínas.
O sistema de defesa da planta utiliza silenciamento de RNA, onde siRNAs duplex são carregados no RISC. A fita passageira é removida, e a fita guia direciona o complexo para degradar o mRNA da GFP alvo.
No entanto, as proteínas efetoras se ligam aos siRNAs, impedindo sua associação com o RISC e permitindo que a fluorescência da GFP persista.
Isso permite a identificação de efetores de patógenos que suprimem o silenciamento de RNA vegetal.
Misture volumes iguais de uma cultura de Agrobacterium contendo a proteína fluorescente verde 35S com uma cultura de Agrobacterium contendo o supressor do vírus mosaico de pepino 35S 2b, efetor putativo ou vetor vazio. Utilizando uma seringa sem agulha de 1 mililitro, infiltre cuidadosamente e lentamente as suspensões mistas de Agrobacterium nos lados abaxiais das folhas de Nicotiana bethamiana 16c.
Remova a suspensão bacteriana restante das folhas com lenços de tecido mole e circule as margens das manchas infiltradas com um caneta marcadora.