Avaliação In Vitro da Morte Bacteriana por Fagocitos Esplênicos de Camundongos Neonatais

Comece dissociando mecanicamente os baços neonatais de camundongos para gerar uma suspensão unicelular.

Transfira a suspensão para um tubo, centrifuge e remova o sobrenadante.

Ressuspenda o pellet em um tampão de lise para eliminar eritrócitos.

Adicione o buffer, centrifuge novamente e remova o sobrenadante.

Ressuspenda as células em buffer e incube com microesferas magnéticas revestidas de anticorpos que visem um receptor expresso em neutrófilos e monócitos inflamatórios.

Centrifuge e remova as esferas soltas. Adicione o buffer, depois passe a suspensão por uma coluna ferromagnética e aplique um campo magnético para manter as células ligadas à esfera.

Remova o campo magnético, elude as células com tampão e as semeie em uma placa de múltiplos poços.

Adicione concentrações crescentes de bactérias luminescentes a poços selecionados.

Incubar para permitir que neutrófilos e monócitos internalizem as bactérias por fagocitose.

Substitua o meio por meio contendo antibióticos para eliminar bactérias não internalizadas.

Registre a luminescência em intervalos regulares para avaliar a internalização bacteriana e a subsequente morte induzida pela fagocitose.

Para realizar um ensaio in vitro de eliminação bacteriana, coloque o baço não infectado em um filtro de nylon de 40 micrômetros dentro de uma placa de Petri estéril de 60 milímetros contendo 5 mililitros de PBS suplementado com soro bovino fetal 10%, e use um êmbolo de seringa estéril de 3 mililitros para desagregar o tecido em uma única suspensão celular. Transfira as células para um tubo centrífugo de 15 mililitros e colete-as por centrifugação. Ressuspenda o pellet em 1 mililitro de tampão de lise de glóbulos vermelhos a cada 3 a 4 baços.

Após 5 minutos em temperatura ambiente, lave os baços em PBS e ressuspenda o pellet em 250 microlitros de PBS suplementado com albumina sérica bovina e 2 milimolares de EDTA para contagem. Em seguida, isole as células B2 positivas para Ly6 com as esferas imunomagnéticas apropriadas de acordo com o protocolo do fabricante e semeie as células positivas enriquecidas para Ly6 B2 em 1 vezes 10 a 5 células por 100 microlitros de meio completo por densidade de poço em uma placa preta ou branca de 96 poços. Prepare o inóculo bacteriano na multiplicidade desejada de infecção em um volume final de 100 microlitros por poço e adicione 100 microlitros de inóculo bacteriano ou meio isoladamente a cada poço, para uma incubação de 1 hora na incubadora de cultura celular.

Ao final da incubação, substitua o meio por 200 microlitros de meio completo fresco suplementado com 100 microgramas por mililitro de gentamicina para remover quaisquer bactérias extracelulares restantes e devolver as células à incubadora de cultura celular por mais 2 horas. Ao final da incubação e em cada ponto experimental subsequente, use um leitor de placas para medir a luminescência em cada poço da placa de cultura com tampa antes de retornar a placa ao incubador de culturas celulares até a próxima leitura.