Avaliação In Vitro da Morte Bacteriana por Fagocitos Esplênicos de Camundongos Neonatais

Comece dissociando mecanicamente os baços neonatais de camundongos para gerar uma suspensão unicelular.

Transfira a suspensão para um tubo, centrifuge e remova o sobrenadante.

Ressuspenda o pellet em um tampão de lise para eliminar eritrócitos.

Adicione o buffer, centrifuge novamente e remova o sobrenadante.

Ressuspenda as células em buffer e incube com microesferas magnéticas revestidas de anticorpos que visem um receptor expresso em neutrófilos e monócitos inflamatórios.

Centrifuge e remova as esferas soltas. Adicione o buffer, depois passe a suspensão por uma coluna ferromagnética e aplique um campo magnético para manter as células ligadas à esfera.

Remova o campo magnético, elude as células com tampão e as semeie em uma placa de múltiplos poços.

Adicione concentrações crescentes de bactérias luminescentes a poços selecionados.

Incubar para permitir que neutrófilos e monócitos internalizem as bactérias por fagocitose.

Substitua o meio por meio contendo antibióticos para eliminar bactérias não internalizadas.

Registre a luminescência em intervalos regulares para avaliar a internalização bacteriana e a subsequente morte induzida pela fagocitose.

Para realizar um ensaio in vitro de eliminação