Detecção In Situ de Bactérias em Seções de Tecido Gengival de Camundongos

Faça uma seção gengival de camundongo infectada com bactérias patogênicas, pré-tratada para acessar DNA bacteriano.

Aplique um tampão com uma sonda de DNA marcada com digoxigenina direcionada ao DNA bacteriano.

Coloque uma cobertura e fele para evitar desidratação da amostra.

Introduza calor para desnaturar o DNA e depois incube sob condições quentes e úmidas para permitir a hibridização da sonda.

Resfrie o ferrolho e remova o revestimento, e lave várias vezes com buffer para remover as sondas soltas.

Adicione uma solução bloqueante para evitar a ligação de anticorpos inespecíficos.

Incubar com anticorpos conjugados enzimáticamente que se ligam à digoxigenina.

Lave para remover anticorpos não ligados.

Adicione um inibidor para inativar seletivamente a enzima endógena.

Aplique um substrato que reaja com a enzima para dar um precipitado colorido.

Enxágue com água para remover o excesso de substrato.

Adicione um corante para tingir os núcleos.

Lave para remover o excesso de corante.

Desidrate em etanol e trate com xileno para aumentar a transparência dos tecidos.

Monte a seção.

Ao microscópio, visualize as bactérias dentro da seção.

Comece o in situ mergulhando primeiro os slides em 2x SSC por 20 min