Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 4:46 min. • January 30th, 2026
Faça uma seção gengival de camundongo infectada com bactérias patogênicas, pré-tratada para acessar DNA bacteriano.
Aplique um tampão com uma sonda de DNA marcada com digoxigenina direcionada ao DNA bacteriano.
Coloque uma cobertura e fele para evitar desidratação da amostra.
Introduza calor para desnaturar o DNA e depois incube sob condições quentes e úmidas para permitir a hibridização da sonda.
Resfrie o ferrolho e remova o revestimento, e lave várias vezes com buffer para remover as sondas soltas.
Adicione uma solução bloqueante para evitar a ligação de anticorpos inespecíficos.
Incubar com anticorpos conjugados enzimáticamente que se ligam à digoxigenina.
Lave para remover anticorpos não ligados.
Adicione um inibidor para inativar seletivamente a enzima endógena.
Aplique um substrato que reaja com a enzima para dar um precipitado colorido.
Enxágue com água para remover o excesso de substrato.
Adicione um corante para tingir os núcleos.
Lave para remover o excesso de corante.
Desidrate em etanol e trate com xileno para aumentar a transparência dos tecidos.
Monte a seção.
Ao microscópio, visualize as bactérias dentro da seção.
Comece o in situ mergulhando primeiro os slides em 2x SSC por 20 minutos. Enquanto isso, dilua a sonda marcada a 1 nanograma por microlitro em buffer de hibridização. Para um controle negativo, use 10 vezes a concentração da sonda não marcada. Depois, desnature as sondas aquecendo-as a 90 graus Celsius por 10 minutos, seguido de resfriá-las rapidamente no gelo.
Em seguida, aplique o mesmo volume de diluição da sonda a cada lâmina que a proteinase K. Depois, cubra cuidadosamente as seções com barbotina e vede com esmalte. Agora, aqueça as lâminas em um bloco de máquina PCR a 90 graus Celsius por 10 minutos e transfira-as para uma incubadora umidificada a 45 graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, resfrie os lâminas a 4 graus Celsius por meia hora e depois remova cuidadosamente as tampas. Os tecidos são frágeis. Por fim, passe as lâminas por uma série de buffers SSC em temperatura ambiente.
Lave as lâminas hibridizadas in situ por 5 minutos em MABT. Depois, aplique de 50 a 400 microlitros de solução bloqueante em 1% entre pré-adolescentes 20 por 20 minutos. Após a incubação em bloco, aplique de 50 a 400 microlitros de 1 a 1000 anticorpos fosfatase alcalina anti-DIG em solução bloqueante.
Deixe se unir por 90 minutos a 37 graus Celsius. Depois de aplicar o primário, lave as lâminas em MABT por 10 minutos. Depois, por 5 minutos, coloque os slides em buffer de detecção com 1% Tween 20.
Agora aplique de 50 a 400 microlitros de 1 milimolar levamisol em solução tampão de detecção em cada lâmina e incube-os por 5 minutos para inativar a fosfatase alcalina endógena. Em seguida, adicione de 50 a 400 microlitros de NBT/BCIP diluído em buffer de detecção de 1 a 100 por lâmina, e deixe as lâminas incubarem por 2 a 3 horas em uma câmara umidificada, com base na experiência.
Enxágue os slides com água DI. Depois, aplique verde de metilo a 0,05% do peso em volume e deixe a contra-coloração agir no tecido por 10 minutos a 37 graus Celsius. Lave as lâminas novamente com água DI e depois desidrate-as com 100% etanol, seguida de um mergulho em xileno. Por fim, aplique 80 microlitros de meio de montagem e cubra as lâminas.