Preparação de Cultura de Agrobacterium para entrega de genes em células vegetais

Comece com uma cultura de Agrobacterium tumefaciens cultivada em meio suplementada com dois antibióticos para evitar contaminação e garantir a retenção de plasmídeos.

As bactérias contêm um vetor de expressão vegetal que carrega um gene de interesse e um gene de resistência a antibióticos.

Eles também contêm um plasmídeo auxiliar com uma região de genes de virulência necessária para entregar o gene de interesse às células vegetais.

Transfira uma porção para um tubo contendo um meio tamponado suplementado com acetosiringona, uma molécula de sinal de origem vegetal, e os antibióticos. Incube com sacudimento.

A acetosiringona se difunde para dentro da célula, desencadeia uma via de sinalização e ativa a expressão dos genes de virulência necessários para a transferência do gene de interesse.

Transfira a cultura, centrifuge para coletar as bactérias e descarte o sobrenadante.

Adicione um tampão de sal e lave as células repetidamente para remover os antibióticos adicionados.

Ressuspenda as bactérias no tampão com acetosiringona e incube sem agitação para manter a expressão gênica da virulência.

Use a cultura imediatamente para uma transformação eficiente.

Use uma ponta para retirar uma colônia po