Preparação de Tecido da Bexiga de Camundongo para Visualização de Infecção Bacteriana

Comece com um camundongo eutanasiado com a bexiga exposta, pré-infectado com bactérias patogênicas.

As bactérias invadem o urotélio e formam colônias. Ao amadurecer, essas bactérias rompem a célula epitelial e infectam as células ao redor.

Insira um cateter conectado a uma seringa cheia de fixador. Injete lentamente o fixador para inflar a bexiga e preservar sua arquitetura.

Clampe a uretra para manter o fixador e a forma da bexiga.

Remova o cateter e corte a uretra. Transfira a bexiga para um fixador novo e incube para preservar a estrutura.

Divida a bexiga em dois copos de meia-bexiga para expor o urotélio e enxágue com um tampão.

Tinga com um reagente à base de metal para aumentar o contraste e depois lave com água ultrapura.

Desidrate as seções usando um gradiente de etanol, seguido de secagem em ponto crítico.

Corte cada copo de bexiga seco ao meio.

A amostra agora está pronta para processamento a jusante para visualizar interações hospedeiro-patógeno.

Uma vez que a seringa de ponta deslizante com tuberculina e fixador, fixe um cateter na ponta, bisel voltado para o lado oposto às marcas da seringa.

Corte o excesso de tubo a 1 a 2 milímetros da ponta da agulha, tomando cuidado para não expor a ponta da agulha. Estale a seringa para remover bolhas e empurre o êmbolo para esvaziar ar. Depois, encha o cateter com fixador sobre um tubo de microcentrífuga. Após anestesiar e sacrificar o rato, uma vez que as pernas estiverem presas, abra a área pélvica do rato com pinças e uma tesoura cirúrgica para expor a bexiga. Empurre cuidadosamente a gordura adjacente para o lado, mas deixe a bexiga no lugar.

Segure a seringa com a mão dominante com a agulha apontando para baixo. Mergulhe a ponta do cateter em lubrificante estéril e posicione a ponta do cateter na abertura uretral, mantendo o cano da seringa afastado em um ângulo de 30 a 45 graus sobre o corpo do camundongo.

Aplique pressão para baixo com um leve movimento no sentido horário e insira suavemente o cateter na uretra. À medida que a ponta do cateter entra, dobradice a seringa em direção à cauda do camundongo enquanto continua deslizando o cateter mais para dentro da uretra até que o corpo da seringa fique paralelo à superfície de trabalho. Toda a agulha do cateter deve entrar no mouse, posicionando a ponta do cateter dentro do lúmen da bexiga. Administre lentamente de 50 a 80 microlitros de fixador, fazendo a bexiga inflar como um balão.

Mantenha o cateter no lugar e levante levemente a seringa, inclinando a ponta para cima. Com a outra mão, abra um hemostado e deslize um dos pinos sob a agulha do cateter na interseção da uretra. Feche parcialmente o hemostado até que ele faça contato com a agulha.

Deslize suavemente a agulha do cateter para fora da bexiga enquanto simultaneamente aperta e trava completamente o hemostado para evitar a perda do fixador. Segure o hemostado de modo que fique paralelo à superfície de trabalho, com a bexiga apoiada em cima. Levante delicadamente e corte cuidadosamente sob o hemostado para remover a bexiga com o hemostato ainda preso.

Coloque a bexiga e o hemostat acoplado em um tubo Falcon contendo o fixador aquecido. Certifique-se de que a bexiga esteja totalmente submersa no fluido e não pressionada contra as paredes do tubo.

Para obter imagens da bexiga por microscopia eletrônica de varredura, corte-a sagittalmente ao meio com uma lâmina de barbear ou bisturi limpa e dupla face, e faça um segundo corte tangencial ao hemostato para liberar a bexiga. Isso resulta em dois copos de meia-bexiga. Se houver alguma almofada de gordura restante na parte externa da bexiga, remova-a suavemente.

Enxágue as metades da bexiga três vezes em buffer de cacodilato de sódio. Tinga o tecido com tetróxido de ósmio a 1% em um tampão de cacodilato de 0,15 molar por 1 hora em temperatura ambiente. Realize essa etapa com o recipiente de tingimento envolto em papel alumínio para manter um ambiente escuro. Após a mancha, enxágue as metades da bexiga três vezes em água ultrapura.

Se houver óleo osmicado na superfície da água, aspire-o ou esvaie para evitar contaminação durante as etapas de secagem. Após desidratar o tecido, corte as metades da bexiga com uma navalha limpa e de dois lados para gerar quatro pedaços no total.