Name: Preparação fatia, cultura de tecidos organotípicas e Gravação luciferase de Atividade Gene Relógio no núcleo supraquiasmático (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-15T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Aprenda a preparar fatias e cultivar o núcleo supraquiasmático de camundongos transgênicos em condições organotípicas. Este método permite registrar continuamente a expressão de genes relógio por bioluminescência com alta resolução temporal.

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Este trabalho foi financiado pelo sueco Medical Research Council (K2009-75SX-21028-01-3, K2008-61X-20700-01-3); FONCICYT 000000000091984, os fundamentos dos Jeansson, Königska Söderström sjukhemmet, Lundqvist Marta e och Sigurd Elsa Goljes Minne e Sociedade Sueca de Medicina SLS-95151. Professor D. Gene Block, UCLA, é reconhecido agradecimento pelos comentários valiosos sobre o manuscrito. Agradecemos ao Dr. Michael Andäng e Dr Helena Johard para o bloqueador dos canais de HCN, e Prof Abdel El-Manira para a prestação de vídeo-microscópio. Considerações éticas: Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Karolinska Institutet e &quot;de Estocolmo Norra Djurförsöksetiska Nämnd&quot;. Todos os experimentos com animais são realizadas com a intenção de minimizar qualquer possível estresse ou desconforto ao animal.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Vantagens e desvantagens com a tecnologia repórter luciferase Em contraste com métodos ex vivo, como RT-PCR, hibridização in situ e Western blot que exigem amostras de tecido em muitos momentos diferentes (dando um tempo de resolução baixa, normalmente de 2-4 horas dependendo da freqüência de amostragem) a fim de estudar diurna variações na expressão dos genes e proteínas, a tecnologia permite que o repórter luciferase de alta resolução (1-10 min) estudos de oscilações circadiano por muitos dias na mesma preparação. Estudos, assim, o número de animais utilizados é minimizado e detalhada dos efeitos sobre a fase e período do ritmo são viáveis, o que normalmente não é possível usar técnicas de amostragem convencional, com tempo de resolução baixa. No entanto, embora as medidas de amplitude relativa do ritmo são possíveis, deve ser enfatizado que a tecnologia repórter não é quantitativa e não pode, portanto, ser utilizada para medir quantidades de genes transcritos ou traduzidos proteínas. As gravações do tecido pode ser iniciado e analisadas imediatamente após o cultivo, uma grande vantagem para estudar diretamente os efeitos do estresse molecular da vivo, em turnos vivo induzida pela luz fase etc A cultura SCN organotípicas permite a manipulação de longo prazo (semanas) farmacológica do cérebro adulto tecido que contém uma rede madura intacta sináptica ea tecnologia repórter luciferase permite gravações estáveis ​​durante muitas semanas. Assim, o tecido não precisa ser pós-neonatal ou cedo, a fim de obter culturas saudáveis, e em contraste com a aguda crônica fatia tratamentos farmacológicos pode ser realizada. Em contraste com o repórter-plasmídeo transfections em culturas de células, o que não fazer levar a incorporação de DNA no genoma, os transgênicos luciferase-modelos animais (bem como lenti-vírus transfections) são favoráveis ​​se alterações epigenéticas estão a ser estudado. Deve, neste contexto, ser mencionado que a imagem de luminescência é hoje possível com câmeras de alta sensibilidade CCD 11, permitindo gravações mesmo em neurônios SCN única (~ 6-10 mm) e outros tipos de células, utilizado por grandes laboratórios estudando ritmos circadianos. Finalmente, vários investigadores circadianos usam geralmente monitoramento de expressão molecular utilizando outros repórteres, como a Proteína Fluorescente Verde, a fim de estudar gene clock / oscilações de proteína 16-19. Aspectos de espessura de corte A espessura recomendada aqui da fatia SCN (200-300 mm) pode ser reduzido ou aumentado, se desejar. No entanto, embora o tecido aplaina para fora da membrana depois de alguns dias em cultura, não é recomendável exceder 500 mM espessura da fatia cortada inicialmente, a fim de preservar a viabilidade do tecido 7. A fatia mais fina do que 100 mm é de razões mecânicas e prática difícil de lidar. Porque o tecido SCN é heterogênea a espessura da fatia pode afetar a fase do sinal de saída luciferase, uma vez que diferentes regiões dentro do SCN (por exemplo, o &quot;core&quot; versus o &quot;shell&quot;, e as regiões dorsal contra ventral) oscilam com diferentes fases 20 e diferencialmente re-sincronizar após a fase de mudanças 21. A espessura da fatia também afeta a linha de base de contagem de fótons, já que mais tecido emite um número maior de fótons. A amplitude das oscilações moleculares podem desta forma ser indiretamente afetada pelo tamanho do explante. Por estas razões, e controle de culturas tratadas deve ser sempre do mesmo tamanho, espessura e contendo a mesma região do SCN, a fim de oscilar na mesma fase e com a mesma amplitude. Os dois núcleos unilateral, por outro lado, oscilam em fase uns com os outros e com amplitudes semelhantes, desde que o corte é vibratome horizontal e não em ângulo (que por sua vez é dependente de que a separação entre corte cerebelo e os dois hemisférios é perpendicular para a superfície da mesa). Um investigador que realiza cultura SCN pode experimentar que as culturas SCN não oscilam em fase uns com os outros. Praticando e padronização da técnica de fatiamento, ou seja, as fatias são sempre cortadas no nível do rostro-caudal mesma do SCN, vai melhorar o resultado. Etapas críticas <ol><li> Suprimento de oxigênio é fundamental. Porque o cérebro requer uma grande quantidade de oxigênio 22, o procedimento de corte precisa ser rápido (Quanto mais próximo 3,1-3,10 é ~ 5-6 minutos o que é melhor para manter os tecidos saudáveis). </li><li> O SCN é sensível às mudanças de temperatura e troca de meio. O SCN é sensível à temperatura e mudanças de temperatura grandes podem mudar a fase de pacemaker e causar artefatos experimentais 23. Se médio ou soluções sejam trocados ou adicionados durante um experimento em andamento, por exemplo, quando a aplicação de uma droga depois de alguns dias em cultura, o meio ou solution precisa ser pré-aquecido a 36-37 ° C (a mesma temperatura na câmara) antes da adição. Em experimentos farmacológicos que envolvem meio de intercâmbios, é importante sempre trabalhar com pré-condicionados meio de cultura celular. Adição / wash-out com frescos, médio incondicionado pode, potencialmente, de mudança de fase do ritmo SCN molecular 24, assim como outras culturas de células de tipo 25. </li><li> Composição do meio. É importante para a cultura do tecido no pH correto e osmolalidade. O meio de ar-buffering contém uma grande quantidade de HEPES, que tem uma ótima capacidade tampão na faixa de pH 6,8-8,2 e também é adequado para o armazenamento temporário de mudanças de pH que podem ocorrer como resultado da respiração celular. HEPES, por outro lado, é mais sensível às mudanças de temperatura em comparação com bicarbonato de sódio, que está incluído em pequenas quantidades no meio de cultura. Bicarbonato de sódio tem uma maior capacidade de buffer no baixo pH (5,1-7,1) Gama 26, portanto, apropriado em uma atmosfera de CO 2. No entanto, aumento da quantidade de bicarbonato de sódio no meio ar-buffering (DMEM 2902) aumenta significativamente a osmolalidade e não podem ser adicionados sem, simultaneamente, diluindo o meio, que por sua vez resulta na composição incorreta de aminoácidos, vitaminas e íons. Conselhos para preparar o meio de: <ol><li> Ser preciso e cuidadoso ao misturar o meio. </li><li> Use soluções estoque fresco ou recém-descongelado. </li><li> Em caso de osmolalidade muito alto não vale a pena diluindo. Mais do que 5-6% de diluição média muito provavelmente não funcionar. Use D-glicose para aumentar a osmolalidade se for muito baixa. </li></ol></li><li> Fase de mudanças devido ao tempo de preparação O tempo de preparação fatia é crítica. Efeito zero ou mínimo na fase é obtido se o procedimento de corte é realizada entre ZT dezembro 06-12. Todos dissecações fatia deve ser realizada na mesma fase do ciclo diurno ou circadiano, a fim de minimizar o erro devido à fase de variação entre as preparações. </li></ol> Possíveis modificações <ol><li> Para eletrofisiologia SCN aguda, o corte tem que ser realizada com uma campainha (Fluid Cerebro Artificial Spinal; ACSF) buffer, saturada com oxigênio (95% O 2, 5% de CO 2) antes do início do corte. Além disso, o oxigênio precisa ser adicionados continuamente ao buffer durante todo o procedimento de corte, como a atividade elétrica e sináptica está diretamente dependentes do fornecimento de oxigênio 22. </li><li> Fatias horizontais e sagital também pode ser preparado com êxito e culta do SCN. Os autores têm experiência com gravações luciferase em fatias horizontais, que de acordo com nossa experiência dar oscilações circadiano com menor amplitude, em comparação com o corte coronal. </li><li> O SCN é de aproximadamente 1 mm de comprimento rostro-caudal e da técnica de corte descrito aqui é voltado para a aquisição de uma seção SCN na região central. No entanto, mais de uma seção SCN pode ser obtido a partir do rato e cérebro de ratos, permitindo a investigação da expressão do gene / proteína circadiano em níveis mais rostral contra caudal do núcleo SCN. </li><li> Culturas fatia de animais mais jovens, os filhotes ou mesmo pós-natal de embriões, também pode ser preparado. Por favor, note que o cérebro eo crânio em filhotes muito jovens são muito macios e sensíveis. Além disso, o nervo óptico é fino e não completamente desenvolvidos. Tome cuidado ao dissecar o cérebro dos filhotes para que a região SCN não está danificado. Por exemplo, ferramentas de micro rongeur não pode ser usado para abrir o crânio de filhotes de rato, porque eles são grandes demais. Tesouras finas são o suficiente para cortar os tecidos moles em filhotes jovens. </li><li> A tampa de vidro técnica de cultura baseada descrito aqui também pode ser usado para luminescência imagem utilizando uma câmera CCD / EM-CCD, também em neurônios SCN único. </li><li> Outras regiões do sistema nervoso central, e os tecidos de órgãos periféricos de transgênicos PER2:: LUC animais pode ser facilmente obtida, culta e analisados ​​em termos de oscilações molecular, como o PER2:: LUC expressão continua a oscilar durante muitos dias também em uma série de outros tecidos e tipos de células 10. A maioria destes tecidos periféricos, por exemplo, o fígado, não precisam de uma membrana para a sobrevivência mas são cultivadas diretamente banhado em 11 médias. Por favor note que, devido à mudança de fase de corte, cultura e troca de mídia não pode seguir os mesmos princípios para SCN. </li></ol> Significado Em camundongos transgênicos e cepas de ratos (mPER2:: LUC; mPer1-luc 8, 10, 27) atividade da enzima luciferase reflete proteína ou ritmos expressão dos genes e pode ser avaliada através da gravação de bioluminescência. A bioluminescência luciferase gerado dá um sinal fraco, mas a luminescência de fundo está perto de zero, tornando este método vantajosa. Além disso, porque a molécula luciferase é instável e rapidamente degradada não há phototoxicidade, que podem aparecer durante a longo prazo iluminação excitatórios 28. Juntas, essas propriedades permitem experimentos de longa duração tornando a tecnologia repórter luciferase altamente vantajoso em pesquisa circadiano.

<table><tbody><tr><td>Suplemento B27 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Cobrevidros</td><td>Menzel-Glaser</td><td>40#1</td><td>&amp;#8776; 40 mm</td></tr><tr><td>Membranas de cultura</td><td>EMD Millipore</td><td>PICMORG50</td><td>0,4 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>DMEM baixa glicose sem vermelho de fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2902</td><td>Pó para 1 L</td></tr><tr><td>Papel filtro</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1003 055</td><td>&amp;#8776; 55 mm</td></tr><tr><td>Conjunto de filtração</td><td>Corning</td><td>431097</td><td>Tamanho de poro 0,22 &amp;#x03BC;m Poliéter sulfona</td></tr><tr><td>Pinceta</td><td>Allgaier Instrumente</td><td>0203-7-PS</td><td>Dumont #7</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Invitrogen</td><td>14065-049</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>NaOCH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 7,5%</td><td>Invitrogen</td><td>25080-060</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Luciferina</td><td>Promega Corp.</td><td>E1602</td><td>Luciferina de besouro, sal de potássio</td></tr><tr><td>Ferramenta micro rongeur</td><td>Allgaier Instrumente</td><td>332-097-140</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep 10.000 U/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>&amp;#8776; 35 mm</td></tr><tr><td>PMT</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>H9319-11MOD</td><td></td></tr><tr><td>Cânulas descartáveis</td><td>Paragon</td><td>P503</td><td>Tamanho 11</td></tr><tr><td>Filtro a vácuo</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-5</td><td></td></tr><tr><td>Graxa para vácuo</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>50 g</td></tr><tr><td>Vibrátomo</td><td>Campden Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparação fatia, cultura de tecidos organotípicas e gravação luciferase de atividade gene relógio no núcleo supraquiasmático

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central de relógio (~ 24 h) circadiano coordenação ritmos diários na fisiologia e comportamento reside no núcleo supraquiasmático (SCN), localizado no hipotálamo anterior. O relógio está diretamente sincronizada com a luz através da retina e nervo óptico. Oscilações circadiano são geradas pela interação loops de feedback negativo de um número dos chamados &quot;genes do relógio&quot; e seus produtos protéicos, incluindo o período (por) genes. O clock do núcleo também é dependente despolarização da membrana, cálcio e cAMP 1. O SCN apresenta oscilações diárias na expressão dos genes, atividade metabólica e atividade elétrica espontânea. Notavelmente, esta atividade cíclica endógena persiste em fatias de tecido adulto do SCN 2-4. Desta forma, o relógio biológico pode facilmente ser estudados in vitro, permitindo investigação molecular, eletrofisiológica e metabólicas da função marca-passo. O SCN é uma pequena estrutura bem definida bilateral localizada logo acima do quiasma óptico 5. No rato que ele contém ~ 8,000 neurônios em cada núcleo e tem dimensões de cerca de 947 mM (eixo de comprimento, rostrocaudal) x 424 M (largura) x 390 M (altura) 6. Para dissecar o SCN é necessário cortar uma fatia do cérebro ao nível específico do cérebro onde o SCN podem ser identificadas. Aqui, descrevemos o processo de dissecação e corte do SCN, que é semelhante para o rato e cérebro de ratos. Além disso, mostramos como a cultura de tecidos dissecados organotypically em uma membrana 7, uma técnica desenvolvida para a cultura de tecidos SCN por Yamazaki et al. 8. Finalmente, demonstrar como tecidos transgênicos podem ser usados ​​para medir a expressão de genes relógio / proteínas usando a tecnologia dinâmico repórter luciferase, um método que originalmente era usado para as medições circadiano por Geusz et al. 9. Nós aqui usam tecidos SCN da transgênicos knock-in período2:: ratos luciferase produzido por Yoo et al 10.. Os ratos contêm uma proteína de fusão do período (PER) 2 ea luciferase enzima vaga-lumes. Quando PER2 se traduz na presença do substrato para a luciferase, ou seja, a luciferina, a expressão PER2 podem ser monitorados como bioluminescência quando luciferase catalisa a oxidação da luciferina. O número de fótons emitidos positivamente correlacionada com a quantidade de proteína produzida PER2, e os ritmos bioluminescência corresponder ao ritmo de proteínas PER2 in vivo 10. Desta forma, a variação cíclica na expressão PER2 pode ser continuamente monitorado em tempo real durante muitos dias. O protocolo que seguimos para cultura de tecidos e gravação em tempo real bioluminescência tem sido exaustivamente descrita por Yamazaki e Takahashi 11.

O processo de preparação de fatias contendo o adulto do rato hipotálamo núcleo supraquiasmático (SCN), e uma maneira rápida para a cultura do tecido SCN em condições organotípicas cultura, são relatados. Além disso, a medição da oscilação expressão da proteína do gene do relógio usando a tecnologia dinâmico repórter luciferase é descrito.

Preparação fatia, cultura de tecidos organotípicas e Gravação luciferase de Atividade Gene Relógio no núcleo supraquiasmático

Um relógio circadiano central (~24 h) que coordena os ritmos diários na fisiologia e no comportamento reside no núcleo supraquiasmático (NSQ) localizado no ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como fatiar e dissecar o núcleo supraquiasmático de camundongos transgênicos e cultivar o tecido esquemático para registrar a expressão de um gene relógio ou proteína como luciferase induzida por luminescência. Isso é realizado primeiramente dissecando o cérebro de um camundongo transgênico que contém um repórter de luciferase para um gene relógio ou proteína, e então produzindo um corte cerebral contendo o núcleo supraquiasmático. O segundo passo do procedimento consiste em dissecar os pequenos núcleos esquemáticos bilaterais a partir do corte.O terceiro passo do procedimento é cultivar o núcleo esquemático explan em uma membrana em uma placa de Petri que contém meio de cultura e luciferina. O passo final do procedimento é registrar a atividade da luciferase medindo a bioluminescência com tubos fotomultiplicadores em uma câmara aquecida hermética à luz. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram oscilação circadiana do gene relógio ou da proteína.Meu nome é Sergey IV e estou trabalhando no Gabrielle Re Club. Meu nome é SoFi Johansson e estou trabalhando na equipe de Gabriella. Meu nome é Gabriel Quist.Sou pesquisador principal do Departamento de Neurociência, e meu nome é Ka LaShon, e sou estudante de doutorado no Centro de Neurociência Médica Sueco, e colaboro com Gabriella. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como Western Blot, R-T-P-C-R e hibridização in situ, é que a expressão de um gene ou proteína circadiano pode ser acompanhada continuamente por muitos dias no mesmo tecido com resolução muito alta de cerca de um minuto, permitindo uma análise detalhada do período, da amplitude e da fase do ritmo circadiano. A demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos de corte e dissecação com lâmina SEN são difíceis de aprender.O SEN é muito pequeno e pode ser difícil de identificar. O procedimento será demonstrado pela Dra. Sge Velia, pesquisadora pós-doutoranda da minha equipe de pesquisa. Após preparar as soluções necessárias, prepare as placas de Petri que serão utilizadas no experimento usando uma seringa de cinco mililitros pré-cheia com graxa para vácuo autoclavada.Aplicar a graxa na superfície superior do anel de uma placa de Petri de 35 milímetros. Preparar uma placa de Petri separada para cada fatia. Cultivo. Encher um tubo Falcon com 10 mililitros de ar, meio de cultura tamponado.Isso produzirá meio suficiente para oito culturas. Adicione 10 microlitros de luciferina recentemente descongelada. A luciferina é sensível à luz; portanto, proteja o meio contendo luciferina da luz armazenando o tubo de Falcon em uma câmara de aquecimento escura a 37 graus Celsius.Em seguida, esterilize todos os instrumentos, lamínulas e demais materiais a serem utilizados no procedimento. Pulverize todos os equipamentos não estéreis com etanol 70%. Exponha os instrumentos e as placas de Petri untadas à radiação UV em uma câmara de fluxo laminar estéril por pelo menos 30 minutos.Outro passo preparatório é configurar o vibratomo e fixar uma lâmina de barbear estéril. O equipamento está agora preparado para o procedimento cirúrgico. Após anestesiar e decapitar um camundongo, remova os olhos da cabeça com uma tesoura.Isso evita estimular ou excitar os nervos ópticos, o que ajuda a prevenir danos ao núcleo esquemático ou SCN. Use uma pinça fina para remover a última vértebra cervical e a pele. Faça dois cortes no osso do crânio ao longo de ambos os lados da cabeça, criando assim uma tampa removível.Abra o crânio com uma ferramenta micro Ron Jre. Use o RJ com um movimento ascendente, nunca pressionando o cérebro com a ferramenta. Para evitar danos ao SCN, remova todo o osso até que os bulbos olfativos possam ser vistos.Use uma tesoura fina de dissecação microcirúrgica para cortar cuidadosamente o nervo óptico entre os hemisférios e os bulbos olfativos. Por favor, coloque uma placa de Petri contendo 50 a 100 mililitros de HBSS frio sob a cabeça do camundongo. Vire a cabeça de cabeça para baixo e permita que o cérebro intacto comece a sair.Corte os outros nervos cranianos conforme necessário no lado oposto ao nervo óptico. Quando destacado, o cérebro cai no recipiente de Petri, o que resfria rapidamente o cérebro. Use uma colher para transferir o cérebro gelado para uma superfície de corte estéril, como a tampa de um recipiente de Petri de vidro virada de cabeça para baixo.Remova o cerebelo fazendo um corte perpendicular com lâminas de barbear estéreis entre os hemisférios e o cerebelo. Aplique cola instantânea na plataforma seca do viome. Insira uma pinça curva fina na parte rostral do cérebro e levante o cérebro segurando-o com a pinça.Seque cuidadosamente o HBSS em papel-filtro estéril. Fixe os hemisférios na cola da plataforma com a ponta rostral voltada para cima e a superfície ventral mais próxima da lâmina de corte. Prenda a plataforma no suporte do vibrátomo e encha-a imediatamente com HBSS frio.Se o corte perpendicular for feito corretamente, os hemisférios devem permanecer eretos. O objetivo é cortar fatias coronais contendo a região mediana do SCN bilateral, utilizando a velocidade máxima do vibrátomo. Comece a cortar seções com espessura de 500 a 800 micrômetros dos hemisférios até alcançar a comissura. Observe.À medida que o quiasma óptico se alarga, acompanhado pela redução das secções a uma espessura de 100 micrômetros, continue cortando no sentido caudal, diminuindo a velocidade do movimento manual horizontal da lâmina até que os dois núcleos SCN começem a aparecer. Use uma lupa, se necessário, para visualizar os núcleos quando o nível do SCN for atingido. Corte uma secção do SCN de 250 micrômetros.Encha uma tampa de placa de Petri de tamanho médio com HBSS frio usando um pincel macio. Levante e transfira a seção cerebral do SCN para a placa de Petri. Coloque a placa de Petri sob um microscópio estereoscópico.O próximo passo é dissecar o SCN fora do corte. Use o microscópio para verificar se o SCN bilateral é claramente visível em pelo menos um lado da seção. Use um par de escalpelos estéreis para dissecar um quadrado de tecido, com cerca de 1,5 milímetros de cada lado, contendo ambos os SCN.Corte o mais próximo possível do SCN. Sem remover o tecido do SCN, um pequeno pedaço do nervo óptico deve estar preso ao explante, mas nenhum outro núcleo deve ser incluído. Corte o tecido contendo o SCN bilateral ao meio para obter dois SCN unilaterais.Pode-se usar um SCN unilateral como controle em uma câmara estéril. Com a luz apagada, adicione 1200 microlitros do meio Lucifer a uma placa de Petri de 35 milímetros de diâmetro e, em seguida, coloque uma membrana de cultura sobre a superfície líquida. Certifique-se de que não haja bolhas de ar sob a membrana.Os implantes são minúsculos e difíceis de manipular. Portanto, utilize uma pipeta de 1000 microlitros com ponteira para aspirar o explante SEN até a ponteira e expeli-lo sobre a membrana de cultura. Descarte o HBSS em excesso e, para a gravação da luciferase, coloque apenas um SEN por placa de Petri.Selar a placa de Petri com graxa usando um cubo de vidro com diâmetro de 40 milímetros. Adicionar mais graxa se o selamento não estiver hermético. Transferir as placas de Petri para o aparelho de ciclo aluma colocado em uma câmara de aquecimento, opaca à luz, mantida entre 36 e 37 graus Celsius.Para iniciar o cultivo, observe as placas de cultura e os conjuntos de detectores de tubos fotomultiplicadores montados dentro da câmara de ciclo lum. Posicione as placas de cultura abaixo dos tubos fotomultiplicadores a aproximadamente um a dois centímetros. Os tubos fotomultiplicadores detectam e amplificam a luciferase induzida pela luminiscência.A ferramenta de software Luma Cycle é utilizada para a aquisição de dados. As contagens de fótons são integradas em intervalos de um a dez minutos para obter alta resolução da expressão da proteína gênica. A expressão circadiana da proteína gênica é analisada para determinar o período, a fase e a amplitude do ritmo.Esta figura mostra gravações de bioluminescência de culturas de tecido SCN saudáveis e não saudáveis. Esses camundongos foram mantidos em 12 horas de luz e 12 horas de escuro antes da remoção do tecido SCN. A linha preta mostra o ritmo circadiano das gravações de bioluminescência da expressão de luciferase do período dois.Em uma fatia de SEN saudável, a proteína oscila com a variação circadiana, na qual a expressão máxima da proteína ocorre no tempo zeitgeber, 12 a 13, ou no início da escuridão. Assim, a fase do ritmo gênico depende do ciclo claro-escuro ao qual o animal foi submetido antes do sacrifício. A linha azul mostra registros de bioluminescência de um SE e cultura que secaram após a abertura da placa de cultura no quarto dia, indicado pela seta, e que não foi selada corretamente novamente.A linha vermelha mostra as gravações de bioluminescência de uma cultura do SCN não saudável. Esta figura utiliza a cultura do SCN em um experimento farmacológico. A figura mostra um traçado de uma cultura que foi tratada com um bloqueador de canais iônicos HCN no momento indicado pela primeira seta.Em um período de dois a três dias, o bloqueador de canais iônicos reduziu e, em seguida, interrompeu a oscilação circadiana na segunda seta. O fármaco foi removido por lavagem e substituído por meio controle condicionado durante a tentativa deste procedimento. É importante lembrar de trabalhar rapidamente, mas com cuidado, para manter o tecido SEN viável.Também é importante padronizar o seu corte com o vibrosserrote para que o mesmo nível do NSV seja obtido a cada vez. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como fatiar e dissecar a cultura do NSV, o órgão do NCS, geralmente sobre uma membrana, e monitorar a expressão do gene ou proteína relógio como luciferase induzida por luminescência nas culturas.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este é um protocolo para preparar e manter uma preparação fatia neocortical na cultura organotípicas com a finalidade de fazer gravações elétrica de neurônios piramidais.

Gravação de células inteiras a partir de uma preparação Slice organotípicas de Neocortex

Relógios circadianos funcionam no interior das células individuais, ou seja, são células-autónomo. Aqui, descrevem métodos para a geração de modelos de células autónomas relógio usando não-invasiva, com base em tecnologia de luciferase bioluminescência em tempo real. Células repórter fornecer tratáveis, sistemas modelo funcional para estudar biologia circadiano.

Monitorização das células-autônomas Ritmos relógio circadiano de expressão genética dos Repórteres Bioluminescência luciferase

Source:&lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove. com/v/57015/single-cell-resolution-fluorescence-live-imaging-of-drosophila-circadian-clocks-in-larval-brain-culture'&gt; Sabado, V., et al., Nagoshi, E. Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Relógios circadianos na cultura do cérebro larval. J. Vis. Exp. (2018). Este vídeo demonstra o procedimento para incorporar o Drosophila cérebro em uma matriz de fibrina, seguido por imagens de fluorescência de lapso...

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Registro eletrofisiológico simultâneo e imagem de cálcio de neurônios do núcleo supraquiasmático

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Rápida análise de fenótipos circadianos em Arabidopsis Protoplastos transfectadas com um relógio Reporter luminescentes

Aqui, descrevemos as configurações para monitorar em paralelo a bioluminescência circadiana e a atividade secretora das células das ilhotas humanas e miotubos primários. Para isso, empregamos a entrega do gene lentiviral de um repórter de relógio central de luciferase, seguido de sincronização in vitro e coleta de meio de saída por perifusão celular contínua.

Medição paralela da expressão do gene relógio circadiano e hormonal secreção em culturas de células primárias humanas

Esta tecnologia baseada em fluorescência recém-desenvolvido permite a monitoração a longo prazo da transcrição de genes do relógio circadiano no núcleo supraquiasmático (SCN) de movimentando-se livremente os ratos em tempo real e em uma alta resolução temporal.

Na Vivo Monitoramento de expressão de Gene relógio circadiano no núcleo supraquiasmático do Mouse usando a repórteres de fluorescência

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Fluorescência de célula única resolução vivo Imaging de Drosophila relógios circadianos em cultura cérebro Larval

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Imagens de bioluminescência em tempo real da dinâmica de sinalização de notch durante a neurogênese de Murine

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Este relatório descreve um método envolvendo um script R no software de código aberto RStudio para analisar conjuntos de dados em larga escala obtidos de experimentos de séries temporais.

Uma análise R poderosa e fácil de usar de conjuntos de dados em grande escala

Aprenda a preparar fatias e cultivar o núcleo supraquiasmático de camundongos transgênicos em condições organotípicas. Este método permite registrar continuamente a expressão de genes relógio por bioluminescência com alta resolução temporal.

Preparação fatia, cultura de tecidos organotípicas e Gravação luciferase de Atividade Gene Relógio no núcleo supraquiasmático

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