Preparação fatia, cultura de tecidos organotípicas e Gravação luciferase de Atividade Gene Relógio no núcleo supraquiasmático

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como fatiar e dissecar o núcleo supramático de camundongos transgênicos e cultivar o tecido esquemático para registrar a expressão do gene ou proteína do relógio como luciferase induzida por luminescência. Isso é feito primeiro dissecando o cérebro de um camundongo transgênico que contém um repórter de luciferase para um gene ou proteína do relógio e, em seguida, fazendo uma fatia do cérebro contendo o núcleo supramático. A segunda etapa do procedimento é dissecar os pequenos núcleos esquemáticos bilaterais da fatia.

A terceira etapa do procedimento é cultivar o núcleo esquemático explicativo em uma membrana em uma placa de Petri que contém cultura, meio e luciferiano. A etapa final do procedimento é registrar a atividade da luciferase medindo a bioluminescência com tubos fotomultiplicadores em uma câmara aquecida à prova de luz. Em última análise, podem ser obtidos resultados que escolheram a oscilação circadiana do gene ou proteína do relógio.

Meu nome é Sergey IV e estou trabalhando no Gabrielle Re Club. Meu nome é SoFi Johansson e estou trabalhando na equipe de Gabriella. Meu nome é Gabriel Quist.

Eu sou um investigador principal do Departamento de Neurociência, e meu nome é Ka LaShon, e sou um estudante de doutorado no Centro Sueco de Neurociência Médica, e colaboro com Gabriella. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes como Western Blot R-T-P-C-R, e em duas hibridações é que a expressão de um gene ou proteína do relógio pode ser seguida continuamente por muitos dias no mesmo tecido com resolução muito alta de cerca de um minuto, permitindo uma análise detalhada da amplitude do período e da face do ritmo circadiano. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de corte e dissecção do SEN são difíceis de aprender.

O NEE é muito pequeno e pode ser difícil de identificar. Demonstrando o procedimento estará o Dr. Sge Velia, um pós-doutorado em minha equipe de pesquisa. Depois de fazer as soluções necessárias, prepare as placas de Petri que serão usadas no experimento usando uma seringa de cinco mililitros pré-preenchida com graxa a vácuo de autoclave.

Aplique a graxa na superfície superior do anel de uma placa de Petri de 35 milímetros. Prepare uma placa de Petri separada para cada fatia. Cultura. Encha um tubo Falcon com 10 mililitros de ar, meio de cultura tamponado.

Isso fará meio suficiente para oito culturas. Adicione 10 microlitros de luciferiano recém-descongelado. O luciferiano é sensível à luz, portanto, proteja o meio luciferiano da luz armazenando o tubo Falcon em uma câmara de aquecimento escura de 37 graus Celsius.

Em seguida, esterilize todos os instrumentos, vidros de cobertura e outros materiais a serem usados no procedimento. Pulverize todos os equipamentos não estéreis com etanol 70%. Exponha os instrumentos e as placas de Petri untadas aos raios UV em um capuz estéril por pelo menos 30 minutos.

Outra etapa preparatória é configurar o vibrato e anexar uma lâmina de barbear estéril. O equipamento agora está configurado para o procedimento cirúrgico. Depois de anestesiar e decapitar um rato, remova os olhos da cabeça com uma tesoura.

Isso evita o treinamento ou excitação dos nervos ópticos, o que ajuda a evitar danos ao núcleo esquemático ou SCN. Use uma tesoura fina para remover a última vértebra cervical e remover a pele. Faça dois cortes no osso do crânio ao longo de ambos os lados do crânio, fazendo assim uma tampa removível.

Abra o crânio com uma micro ferramenta Ron Jre. Use o RJ com um movimento ascendente nunca pressionando o cérebro com a ferramenta. Para evitar danos ao SCN, remova todo o osso até que os bulbos olfatórios possam ser vistos.

Use uma tesoura de mola de microdissecação fina para cortar cuidadosamente o nervo óptico entre os hemisférios e os bulbos olfatórios. Por favor. Uma placa de Petri cheia de 50 a 100 mililitros de HBSS frio sob a cabeça do rato. Vire a cabeça de cabeça para baixo e deixe o cérebro intacto começar a cair.

Corte outros nervos cranianos conforme necessário no lado oposto do nervo óptico. Quando separado, o cérebro cai na placa de Petri, que resfria rapidamente o cérebro. Use uma colher para transferir o cérebro gelado para uma superfície de corte estéril, como uma tampa de placa de Petri de vidro virada de cabeça para baixo.

Remova o cerebelo fazendo um corte perpendicular com lâminas de barbear estéreis entre os hemisférios e o cerebelo. Aplique supercola na plataforma seca do viome. Insira uma pinça curva afiada na parte rostral do cérebro e pegue o cérebro segurando o cérebro com a pinça.

Seque cuidadosamente o HBSS em papel de filtro estéril. Fixe os hemisférios na cola da plataforma com a ponta rostral para cima e a superfície ventral mais próxima da lâmina de corte. Prenda a plataforma no suporte de vibrato e encha-a imediatamente com HBSS frio.

Se o corte perpendicular for feito corretamente, os hemisférios devem ficar retos. O objetivo é cortar cortes coronais contendo a região média do SCN bilateral, utilizando a velocidade máxima do vibrato. Comece cortando seções de 500 a 800 micrômetros de espessura dos hemisférios até atingir a comissura. Relógio.

À medida que o quiasma óptico fica mais largo, acompanhado pela redução das seções para 100 micrômetros de espessura, continue cortando na direção do mimo, diminuindo o movimento manual horizontal da lâmina até que os dois núcleos SCN comecem a aparecer. Use uma lupa, se necessário, para visualizar os núcleos quando o nível do SCN for atingido. Corte uma seção SCN de 250 micrômetros.

Encha uma tampa de uma placa de Petri de tamanho médio com HBSS frio usando uma escova macia. Levante e transfira a seção cerebral do SCN para a placa de Petri. Coloque a placa de Petri sob um microscópio de dissecação.

O próximo passo é dissecar o SCN da fatia. Use o microscópio para verificar se o SCN bilateral é claramente visível em pelo menos um lado da seção. Use um par de bisturis estéreis para dissecar um quadrado de tecido, cerca de 1,5 milímetros de cada lado contendo os dois SCNs.

Corte o mais próximo possível do SCN. Sem remover o tecido do SCN, um pequeno pedaço do nervo óptico deve ser anexado ao explan, mas nenhum outro núcleo deve ser incluído. Corte o tecido contendo o SCN bilateral ao meio para obter dois SCNs unilaterais.

Um SCN unilateral pode ser usado como controle em um capuz estéril. Com a luz apagada, adicione 1200 microlitros do meio Lúcifer a uma placa de Petri de 35 milímetros de diâmetro e, em seguida, coloque uma membrana de cultura no topo da superfície do líquido. Certifique-se de que não haja bolhas de ar sob a membrana.

Os implantes são minúsculos e difíceis de pegar. Portanto, use uma pipeta de 1000 microlitros com ponta para sugar a explicação SEN para dentro da ponta e pressione-a na membrana de cultura. Descarte o excesso de HBSS para registro de luciferase e coloque apenas um SEN por placa de Petri.

Sele a placa de Petri de graxa com uma lamínula de 40 milímetros de diâmetro. Adicione mais graxa se a vedação não estiver apertada. Transfira as placas de Petri para um aparelho de ciclo aluma colocado em uma câmara de aquecimento estanque à luz de 36 a 37 graus Celsius.

Para começar a cultivar, observe as placas de cultura e os conjuntos de detectores de tubos fotomultiplicadores montados dentro da câmara do ciclo de lum. Coloque as placas de cultura abaixo dos tubos fotomultiplicadores aproximadamente um a dois centímetros. Os tubos fotomultiplicadores detectam e amplificam a luciferase induzida pela luminescência.

A ferramenta de software Luma Cycle é usada para aquisição de dados. As contagens de fótons são integradas em intervalos de um a 10 minutos para obter alta resolução da expressão da proteína gênica. A expressão circadiana da proteína do gene é analisada para determinar o período de fase e a amplitude do ritmo.

Esta figura mostra registros de bioluminescência de culturas de tecidos SCN saudáveis e não saudáveis. Esses camundongos foram mantidos em 12 horas de luz e 12 horas de escuridão antes da remoção do tecido SCN. A linha preta mostra o ritmo circadiano das gravações de bioluminescência da expressão da luciferase do período dois.

Em uma fatia de SEN saudável, a proteína oscila com a variação circadiana em que a expressão máxima da proteína ocorre no tempo ze gaber, 12 a 13 ou no início da escuridão. Assim, a fase do ritmo genético depende do cronograma claro e escuro em que o animal foi mantido antes do sacrifício. A linha azul mostra registros de bioluminescência de um SE e cultura que secou depois que a placa de cultura foi aberta no quarto dia indicado pela seta e não selado corretamente.

A linha vermelha mostra registros de bioluminescência de uma cultura SCN não saudável. Esta figura usa a cultura SCN em um experimento farmacológico. A figura mostra um traço de uma cultura que foi tratada com um bloqueador de canais iônicos HCN no momento indicado pela primeira seta.

Ao longo de dois a três dias, o bloqueador do canal iônico reduziu e interrompeu a oscilação circadiana na segunda seta. A droga foi lavada e substituída por meio de controle condicionado durante a tentativa deste procedimento. É importante lembrar de trabalhar rapidamente, mas com cuidado, para manter o tecido NEE viável.

Também é importante padronizar o corte do vibram para que o mesmo nível de SEN seja obtido a cada vez. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fatiar e dissecar a cultura NEE, o órgão SCN, normalmente em uma membrana e monitorar a expressão do gene ou proteína do relógio como luciferase induzida por luminescência nas culturas.