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Microbiologia
0 vistas • 2:46 min • February 26th, 2026
Comece pelo sobrenadante produzido pela microbiota intestinal humana durante a fermentação in vitro de exopolissacarídeos. O sobrenadante contém ácidos graxos de cadeia curta desprotonados (SCFAs) e outros metabólitos.
Adicione ácido metafosfórico para baixar o pH do sobrenadante e o vórtice para misturar completamente. Isso converte os SCFAs em suas formas protonadas, adequadas para análise de cromatografia gasosa.
Centrifugar para separar os detritos e coletar o sobrenadante contendo SCFAs e outros metabólitos.
Filtre o sobrenadante para eliminar resíduos residuais e evitar interferência na cromatografia.
Em um sistema de cromatografia gasosa de alto desempenho, injete o sobrenadante na entrada aquecida para vaporizá-lo. Depois, misture o vapor com um gás inerte e o faça passar por uma coluna polar de fase estacionária para separação.
Os SCFAs interagem com a fase estacionária da coluna e se separam com base em sua volatilidade, com ácidos de cadeia mais curta eluindo antes dos mais longos.
Identifique as concentrações de diferentes SCFAs comparando os resultados com padrões internos. Isso reflete a degradação microbiana dos exopolissacarídeos em condições semelhantes ao intestino
Para estudar os efeitos do EPS na produção de SCFA, adicione 1 mililitro dos supernadantes fermentados a tubos de centrífuga de 2 mililitros e adicione 0,2 mililitros de 25% de peso por cento de ácido metafosfórico em cada amostra. Vortex para misturar bem as soluções. Centrifuge as misturas a 13.000 vezes g por 20 minutos.
Enquanto isso, prepare soluções de 120 milimolares ácidos acético, propiônico, butírico, isobutírico, valérico e isovalérico em tubos. Depois, adicione 1 mililitro de cada ácido preparado em um tubo contendo 1,2 mililitros de ácido metafosfórico com 25% de peso/volume e os coloque na amostra do instrumento de cromatografia gasosa como coquetéis padrão.
Tire os tubos da centrífuga e transfira os sobrenacionantes para tubos novos. Use uma seringa equipada com filtro de 0,22 micrômetro para filtrar os supernadantes em novos tubos para análise gasocromatografia.