Imagem em lapso de tempo da segregação cromossômica em bactérias marcadas fluorescentemente

Comece com uma base de agarose rica em nutrientes em uma estrutura metálica contendo bactérias que expressam origens cromossômicas marcadas fluorescentes e microsferas fluorescentes.

A almofada de agarose suporta a fixação e mobilidade bacteriana, e microsferas fluorescentes servem como referência para rastrear a segregação cromossômica.

Adicione óleo de imersão à lente objetiva na câmara de incubação pré-aquecida de um microscópio de campo aberto invertido.

Coloque a amostra sobre a lente e então foque em uma região contendo múltiplas bactérias e pelo menos uma microsfera fluorescente.

Inicie imagens em time-lapse e capture imagens de contraste de fase e de fluorescência.

A origem de replicação marcada fluorescente aparece como um aglomerado brilhante próximo a uma extremidade da célula.

Durante a divisão, a origem duplica; um agrupamento permanece na extremidade original enquanto o outro agrupamento migra para a extremidade recém-formada da célula.

Esse sistema permite o acompanhamento da segregação cromossômica em múltiplas divisões e pode ser adaptado para visualizar processos dinâmicos semelhantes em outras bactérias, incluindo espécies patogênicas durante interações com hospedeiros.

Para realizar a microscopia em time-lapse, ligue o microscópio e inicie o software de controle do microscópio. Selecione o objetivo correto, os espelhos corretos e filtre para adquirir imagens de contraste de fase, bem como imagens de proteínas verde-fluorescentes, vermelhas-fluorescentes ou amarelas-fluorescentes. Adicione uma gota de óleo de imersão de alta qualidade sobre a lente do objetivo e no fundo da amostra pré-incubada a 32 graus Celsius.

Com o lado do furo voltado para o objetivo, coloque a estrutura metálica com a amostra sobre o palco do microscópio e depois prenda a amostra firmemente no suporte do palco. Foque nas células movendo o palco na direção Z mais próximo do objetivo. Quando o óleo no objetivo e a amostra fizer contato, mova o estágio na direção X/Y.

Mude para o software Metamorph e abra a ferramenta Acquir. Selecione Contraste de Fase na lista suspensa de Configurações e defina o Tempo de Exposição para 100 milissegundos. Clique em Mostrar ao Vivo, Trazer a Célula para o Plano Focal e desloque o palco na direção X/Y até que várias células individuais fiquem visíveis no campo de visão.

Certifique-se de que pelo menos uma microsfera fluorescente esteja na região de visão para alinhar posteriormente as imagens adquiridas. Em seguida, abra o assistente de Aquisição Multidimensional do software de controle do microscópio para configurar um experimento de time-lapse que permita ao microscópio adquirir imagens em múltiplos comprimentos de onda e posições de estágio, se necessário.

Na aba principal, ative time-lapse e Múltiplos Comprimentos de Onda. Abas adicionais aparecerão no lado esquerdo da janela. Clique na aba Salvar e selecione Diretório para selecionar uma pasta vazia no disco rígido do computador para salvar as imagens adquiridas, depois ative o Nome Base Incrementar Se o Arquivo Existir para garantir que os conjuntos de dados consecutivos não sobrescrevam os anteriores. Dê ao experimento um nome com data e o nome ou título da cepa.

Clique na aba de time-lapse para ajustar os parâmetros do time-lapse, depois defina o Intervalo de Tempo para 20 minutos e defina a Duração para 24 horas. O número de pontos de tempo muda automaticamente. Agora, clique na aba Comprimentos de Onda.

Selecione o número de comprimentos de onda a serem adquiridos para cada imagem em cada ponto de tempo mudando o número. Selecione permitir posição de AF memorizada separada por hardware para cada comprimento de onda. Clique na aba Primeiro Comprimento de Onda do topo.

Na lista suspensa de Iluminação, selecione Contraste de Fase. Selecione 100 milissegundos para exposição e, na lista suspensa Adquirir, selecione Cada Ponto de Tempo. Desative o Auto Expose na lista suspensa selecionando Nunca, e selecione Cada Aquisição na lista suspensa para Foco Automático.

Defina a exposição para cada comprimento de onda, conforme demonstrado usando os seguintes parâmetros. Depois, para adquirir imagens de múltiplas posições de palco, na aba Principal, ative Múltiplas Posições de Palco. Clique na aba Palco e clique no botão Live para ver o campo de visão.

Mova o palco na direção X/Y até que um retorno de investimento esteja no campo de visão. Salve as coordenadas X e Y na aba Stage clicando no sinal de mais. Mova o palco novamente na direção X/Y até encontrar um novo ROI e salve as coordenadas novamente clicando no sinal de mais.

Continue até que o número desejado de regiões seja salvo. Verifique mais uma vez que as células estão em foco clicando nas diferentes posições X e Y salvas, e inicie o autofoco do hardware clicando em AFC hold para manter a posição Z salva constante durante o experimento. Inicie a gravação em time-lapse no assistente de Aquisição Multidimensional do software de controle do microscópio clicando em Adquirir.

Verifique se as células ainda estão em foco após os primeiros pontos de tempo nas gravações em time-lapse para maximizar a qualidade das imagens e refocar se necessário.