Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 3:48 min. • February 26th, 2026
Comece com um peixe-zebra adulto infectado com uma cepa resistente a antibióticos de Vibrio cholerae. Essa bactéria patogênica expressa a enzima β-galactosidase e coloniza o trato intestinal.
Pegue o peixe e transfira-o para uma solução contendo uma overdose de anestésico para eutanasiá-lo.
Coloque o peixe com o lado ventral para cima e prenda-o com alfinetes.
Desinfete o abdômen, faça uma incisão longitudinal na pele e duas incisões laterais em direção à cabeça, depois prenda a pele para expor o trato intestinal.
Transfira o trajeto para um tubo de homogeneização contendo um tampão frio com esferas de vidro.
Incube com agitação, permitindo que as contas de vidro desorganizem o tecido e liberem as bactérias.
Dilua em série o homogeneado, emplace-o no meio e incube. O meio contém um substrato cromogênico de β-galactosidase e um antibiótico para eliminar contaminantes.
As bactérias expressam a enzima β-galactosidase, que hidrolisa o substrato cromogênico, levando à formação de colônias pigmentadas de azul.
Conte as colônias para estimar a carga bacteriana intestinal.
Quando o experimento atingir o desfecho desejado, colete uma amostra de 15 mililitros da água da infecção para fins diagnósticos. Depois, recolha os peixes e descarte a água infectada adequadamente. Oriente o lado ventral para cima e fixe o corpo com um pino na mandíbula inferior e outro pino logo atrás do ânus.
Incline os dois pinos para longe do corpo. Em seguida, limpe a superfície ventral do peixe com 70% de etanol. Depois, esterilize um bisturi e uma tesoura Vannas usando 70% de etanol e uma chama.
Agora, usando o bisturi, faça uma pequena incisão longitudinal na barriga que penetre as escamas, mas corte apenas até a profundidade da pele. Em seguida, com a tesoura, estenda a incisão cuidadosamente ao longo do corpo, cortando não mais profundo que a pele. Evite cortar o ânus.
Depois, faça dois cortes laterais em direção à cabeça para expandir a abertura. Depois, prenda a pele de cada lado das incisões laterais à superfície de dissecação, inclinando os pinos para fora, afastando-se do corpo. O trato intestinal agora deve ser visível como um tubo muito fino e pálido.
Agora, use dois pares de pinças esterilizadas com chama para remover cuidadosamente todo o trato intestinal, que pode ser bastante frágil. Transfira o tecido para um tubo de homogeneização contendo esferas de vidro e um mililitro de tampão frio. Em seguida, homogeneize os tecidos conforme descrito no protocolo de texto e quantifique os níveis de colonização intestinal.
Em seguida, faça diluições seriadas do homogeneado e do tampão intestinais. Para cada peixe, prepare cinco ou seis diluições dez vezes mais em volumes de um mililitro. Faça vórtice nos tubos para misturar.
Depois, placar de 100 a 200 microlitros de cada diluição em placas LB de ágar contendo estreptomicina e X-gal. Incube as placas a 30 graus Celsius por 16 a 18 horas. Após a incubação durante a noite, conte as colônias de V. cholerae nas placas.
Essas bactérias normalmente produzem colônias azul-claro em meio LB com X-gal.