Quantificação da Carga Bacteriana Tecidular em um modelo camundongo de infecção intestinal crônica

Comece com um camundongo eutanasiado infectado por uma cepa bacteriana resistente a antibióticos que modela infecção intestinal crônica.

Expõe a cavidade abdominal para acessar o ceco e o baço.

Colhe os tecidos cecal e esplênico, que representam locais intestinais e sistêmicos de colonização bacteriana.

Coloque cada lenço em um tubo separado contendo um tampão e uma esfera de aço.

Homogeneize o tecido agitando rapidamente os tubos, fazendo com que as esferas de aço colidam com o tecido, o decomponham e liberem bactérias na suspensão.

Realize diluições seriadas dos homogeneados no tampão para reduzir a concentração bacteriana.

Alíquotas de placas de cada diluição sobre ágar nutritivo suplementado com antibiótico para recuperar seletivamente bactérias resistentes a antibióticos.

Incube as placas para permitir que bactérias viáveis cresçam em colônias.

Conte as colônias para estimar o número de bactérias viáveis por grama de tecido e compare as cargas bacterianas no ceco e no baço.

Primeiro, coloque microtubos de fundo redondo com trava de 2 mililitros com trava de cofre, adicione 1 mililitro de PBS estéril e uma conta de aço inoxidável autoclavada em cada tubo. Antepese os tubos antes da coleta do tecido.

Após a eutanásia dos camundongos, resseque seus tecidos cecais e esplênicos, certificando-se de coletar tecido de animais individuais em tubos separados. Pese cada tubo para determinar o peso dos tecidos.

Use um aparelho de mistura para homogeneizar os tecidos a 30 hertz por 15 minutos. Depois, transfira 900 microlitros de PBS para cada poço de um megabloco de 96 poços de 2 mililitros. Pipete 100 microlitros de tecido homogenados no primeiro poço e misture bem.

Realize diluições seriadas adicionando 100 microlitros aos poços subsequentes, até que se obteça uma diluição de 10 elevado à sexta diluição negativa. A placa 10 microlitros de cada diluição triplica em ágar LB que contém estreptomicina. Depois, conte as unidades médias de formação de colônias e determine as unidades formadoras por grama de tecido conforme descrito no protocolo de texto.