Processamento de Tecidos Infectados para Enumeração Bacteriana em um Modelo de Co-Infecção de Camundongos

Comece com um camundongo co-infectado por uma bactéria patogênica e um vírus.

O vírus danifica o revestimento epitelial do trato respiratório superior do camundongo, facilitando a disseminação das bactérias da nasofaringe para os pulmões.

Coloque os pulmões de camundongo colhidos em um recipiente contendo soro salino tamponado com fosfato, ou PBS.

Triturar os pulmões em pedaços pequenos e misturar bem.

Transfira metade do tecido pulmonar para um tubo contendo PBS.

Coloque uma sonda homogeneizadora de tecido esterilizado dentro do tubo contendo o tecido pulmonar.

Homogeneize o tecido para liberar as bactérias no PBS.

Dilua o homogeneado e place as diluições em uma placa de ágar rica em nutrientes.

Incube a placa para permitir a formação de colônias bacterianas.

Conte essas colônias para quantificar a carga bacteriana pulmonar, que reflete a carga bacteriana nos pulmões.

Para a coleta pulmonar, usando tesouras de dissecação, corte as laterais da caixa torácica exposta e puxe suavemente as costelas para cima, em direção à cabeça do camundongo, expondo o coração. Insira uma agulha calibre 25 presa a uma seringa de 10 mililitros pré-cheia de PBS no ventrículo direito e comece a perfusar lentamente. Procure por branqueamento pulmonar como indicador de perfusão bem-sucedida.

Lave lentamente para evitar quebrar o tecido pulmonar. Levante o coração com pinças e faça um corte para separar os pulmões do coração. Uma vez separados, recolha todos os lobos do pulmão com pinças e enxágue em um recipiente com PBS estéril para remover qualquer sangue residual.

Em uma placa de Petri, triture o pulmão em pedaços pequenos e misture bem. Remova metade da mistura pulmonar para determinar a UFC bacteriana ou PFU viral e coloque-a em um tubo de fundo arredondado de 15 mililitros pré-preenchido com 0,5 mililitros de PBS para homogeneização.

Para homogeneizar o tecido coletado, limpe a sonda do homogeneizador colocando-a em etanol a 70% e ligando o homogeneizador a 60% de potência por 30 segundos. Repita essa etapa em água estéril por 10 segundos.

Homogeneize cada tecido por 1 minuto. Para enumeração dos números bacterianos, diluições seriadas de placas em placas de ágar sanguíneo. Para calcular a UFC total, use 10 microlitros para placar e anote o volume final em mililitros para cada amostra. Incube durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.