Gravações pós-sinápticos em Dendrites aferente entrar em contato com células ciliadas da cóclea: Release multivesiculares Monitoramento em uma fita Synapse
10 de fevereiro de 2011
Whole-cell patch-clamp gravações de dendritos do nervo auditivo fibra no interior da fita sinapse das células ciliadas da cóclea de mamíferos.
O objetivo geral deste procedimento é registrar a atividade pós-sináptica nas sinapses aferentes das células ciliadas internas. Isso é feito expondo primeiro o epitélio sensorial de uma cóclea recentemente removida de um rato decapitado. A segunda etapa do procedimento é posicionar o apical excisado, ligar uma lamínula modificada e transferi-la para a câmara de registro.
A terceira etapa do procedimento é localizar e obter acesso a uma batuta aferente com um eletrodo de gravação. A etapa final do procedimento é formar uma vedação hermética e, em seguida, romper a membrana de fibra aferente, estabelecendo toda a configuração celular da técnica de patch clamp. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a ocorrência pós-sináptica ou potenciais de uma única sinapse de fita por meio da eletrofisiologia do grampo de remendo de células inteiras.
A demonstração visual desse método é crítica, pois a dissecção e a preparação do tecido coclear são difíceis de aprender e as pequenas fibras aferentes são difíceis de reconhecer e acessar. Antes de iniciar a dissecção, prepare uma lamínula modificada que manterá a preparação no lugar durante as gravações. Usando uma lamínula de vidro circular de oito a 12 milímetros, aplique uma gota de meia proteção de syl curada em direção à borda da lamínula.
Coloque a ponta grossa de um alfinete de inseto fino na lamínula. Segure o pino de inseto firmemente contra o vidro. Com uma pinça, aqueça a proteção do peitoril contra uma serpentina aquecida para endurecer.
Prepare 10 a 20 microeletrodos conforme descrito no texto anexo. Após o polimento a fogo com uma micro forja, o microeletrodo deve ter um diâmetro de ponta externa de aproximadamente um mícron. A espessura final da parede da pipeta é igual a cerca de um terço de micrômetro após anestesia e decapitação de um rato de três semanas de idade.
Comece a dissecção removendo a pele bi dissecando a cabeça e removendo o cérebro Para expor o osso temporal, remova os dois ossos temporais. Coloque cada osso temporal em uma placa de dissecação limpa contendo solução extracelular padrão. O próximo passo é remover o osso, encapsulando o osso temporal, de modo a expor a cóclea.
Segure o osso temporal firmemente na base com um par de pinças. Identifique a janela redonda e oval e a cóclea. Oriente a cóclea de modo que a janela oval e o lado em espiral da cóclea fiquem voltados para cima.
Remova o excesso de osso ao redor da cóclea. Use um segundo par de pinças finas para lascar o osso diretamente da cóclea, começando com a área que é mais transparente do que o resto do osso. Aqui o osso é mais fino e mais fácil de remover.
Continue removendo o osso ao redor da bobina apical. Use uma tesoura de dissecação micros para cortar o modis abaixo da curva apical. Em seguida, desconecte o giro apical das voltas inferiores da cóclea.
Tome cuidado para proteger a bobina apical. Não deve ser puxado ou esticado. Finalmente, remova a volta apical da cóclea sem rasgar muito o tecido.
Use uma pinça fina para remover o resto do osso. O próximo passo é remover o STR do oculis e a membrana tial. Remova cuidadosamente o STR do olho, a tira brilhante de tecido situada fora da região da célula ciliada.
Certifique-se de evitar a remoção das células ciliadas sensoriais, que podem facilmente se desprender junto com a STR do olho. Em seguida, use uma pinça fina para desprender a membrana tial. A membrana semitransparente brilhante que fica acima das células ciliadas sensoriais agora corta o excesso de tecido e osso e achata a preparação com a pinça.
Isso é necessário para que o tecido possa ser colocado uniformemente sob um alfinete. A dissecação está concluída. Coloque a preparação sob o alfinete na lamínula preparada, tomando cuidado para posicionar o alfinete longe das células ciliadas assim que a dissecção estiver concluída.
Use uma pinça para transferir a preparação para a câmara de registro, mantendo uma gota de fluido extracelular na lamínula que segura o tecido coclear imediatamente começa a profusão com a solução extracelular. Para garantir uma melhor sobrevivência da preparação, use a objetiva de 10 x do microscópio ou a objetiva DIC de imersão em água de 40 x. Para localizar a preparação, oriente a preparação de forma que os eletrodos de registro possam se aproximar das células ciliadas internas em ângulo reto com suas paredes laterais.
Se a visibilidade da região basal das células ciliadas internas for limitada porque a preparação está enrolada, use um eletrodo de registro para empurrar a borda externa da preparação para baixo contra a lamínula de cobertura. Tomando cuidado para evitar pressionar as próprias células ciliadas internas. Nesta preparação, o eletrodo superior está segurando a borda externa da preparação nas marcas inferiores do eletrodo onde os bastões aferentes estão localizados.
Para referência, a câmera NC 70 Nuv Con exibe a imagem ampliada Forex no monitor para avaliar se o tecido na região interna das células ciliadas está saudável. Encontre os feixes de cabelo como ponto de referência e concentre-se para encontrar os núcleos. Concentre-se mais abaixo em direção à base das células ciliadas internas com suas terminações aferentes e volte para cima até atingir o nível dos núcleos no monitor.
Agora localize os bastões aferentes ao redor da base das células ciliadas internas. Os bastões são esféricos ou elipsoidais, com aproximadamente um mícron de diâmetro e são de cor clara com uma aparência brilhante. Você os encontrará focando para cima e para baixo.
O próximo passo é abrir caminho para as fibras aferentes usando um eletrodo de gravação com uma ponta de um mícron preenchida com solução intracelular. Aplique pressão positiva e use o micro manipulador para manobrar o eletrodo para a preparação. Use este eletrodo para fazer uma incisão na preparação ao nível da base interna da célula ciliada.
Empurre o eletrodo entre a fina camada de células de suporte e as células ciliadas internas usando pressão positiva para forjar uma rota de acesso à área na base das células ciliadas internas. Remova cuidadosamente o eletrodo e substitua-o por um eletrodo novo com uma ponta de um mícron de diâmetro preenchida com solução intracelular. Usando pressão positiva para manter uma ponta de eletrodo limpa, mova o eletrodo de registro através do orifício de acesso ao redor das células de suporte adjacentes em direção ao bastão aferente.
Certifique-se de que a ponta do eletrodo esteja diretamente na frente dos bastões de bastão aferentes que oferecem mais resistência ao movimento da pipeta do que as células de suporte e a membrana interna das células ciliadas. Essa diferença pode ser sentida à medida que a pipeta é movida, mova a pipeta para cima e para baixo e empurre para garantir que o bhuton se mova. Isso indica que a ponta da pipeta e o bhuton estão no mesmo plano de foco com o eletrodo pressionado contra o bhuton aferente Libere simultaneamente a pressão positiva e aplique sucção para formar uma vedação de giga ohm.
Aplique rajadas suaves de sucção para romper a membrana dentro do eletrodo para obter um registro de célula inteira. Se a célula remendada for um bastão aferente, pequenos transientes capacitivos são observados no modo de gravação de toda a célula. Esta figura mostra transientes típicos registrados de uma fibra aferente.
Comece a registrar a atividade sináptica. Se a fibra aferente não apresentar atividade espontânea, despolarize a célula ciliada aplicando uma solução extracelular com maior concentração de potássio. Esta figura mostra as relações típicas de tensão de corrente para fibras AFF à esquerda e células ciliadas internas à direita.
As relações de tensão de corrente foram registradas em um potencial de retenção de menos 84 milivolts com passos de tensão de menos 124 milivolts a 36 milivolts positivos em incrementos de 10 milivolts. As tensões são mostradas à direita de alguns traços com foco nas relações de tensão de corrente de uma fibra aferente. Observe que a ocorrência pós-sináptica excitatória ou EPCs estão presentes durante a maioria das etapas de tensão.
Os EPCs reverteram um positivo em cerca de seis milivolts positivos. Este registro foi realizado na presença de tetra para toxina para bloquear correntes de sódio dependentes de voltagem sem o bloqueador Correntes internas de sódio de ativação rápida teriam aparecido adicionalmente na gravação e identificado a gravação como uma gravação de fibra aferente. Observe a corrente interna de ativação lenta em tensões hiperpolarizantes.
Essa corrente não está presente nas células ciliadas internas ou nas células de suporte e fornece uma boa indicação de que a gravação é de uma fibra aferente. Essas gravações mostram as relações de tensão de corrente para uma célula ciliada interna. A seta aponta para as correntes de potássio de ativação rápida em potenciais positivos.
Estes são seguidos por correntes de potássio retificadoras devido a um diâmetro estreito da pipeta e alta resistência de acesso. As correntes internas das células ciliadas mostradas aqui são menores do que o esperado para obter registros precisos das correntes internas das células ciliadas. Pipetas com resistências de acesso mais baixas devem ser usadas.
No entanto, as gravações aqui apresentadas demonstram que as relações de tensão de corrente das células ciliadas internas e das fibras aferentes podem ser claramente distinguidas. Esta figura mostra as correntes sinápticas registradas de uma fibra aferente. Observe o tamanho e a forma variáveis dos EPCs.
Os registros foram feitos em temperatura ambiente com tetra toína aplicada para bloquear as correntes de sódio dependentes de voltagem. Esta figura mostra gravações simultâneas de uma célula ciliada interna e um bastão aferente em contato. Um passo de voltagem foi usado para despolarizar a célula ciliada interna e, em resposta, as correntes de cálcio internas foram registradas a partir do influxo de cálcio da célula ciliada interna, resultando na liberação de neurotransmissores e EPCs ativadas no bastão aferente.
Observe que a depressão sináptica aparece durante uma despolarização interna das células ciliadas de 50 milissegundos ao tentar este procedimento. É importante lembrar de ter cuidado ao dissecar e preparar o tecido coclear e permanecer paciente e otimista ao tentar gravar a partir de terminais aferentes.
Visão Geral
Este artigo descreve um procedimento para gravações de patch-clamp em células inteiras a partir dos dendritos das fibras do nervo auditivo na sinapse em fita da célula ciliar interna na cóclea de mamíferos. O método tem como objetivo capturar a atividade pós-sináptica em sinapses aferentes, proporcionando insights sobre o processamento auditivo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Eletrfisiologia
- Biologia Auditiva
Contexto Geral
- A técnica de patch-clamp em células inteiras é essencial para o estudo da transmissão sináptica.
- A sinapse em fita da célula ciliar interna desempenha um papel fundamental no processamento do sinal auditivo.
- O acesso às fibras aferentes pequenas é tecnicamente desafiador.
- A demonstração visual auxilia na compreensão da dissecação e preparação do tecido coclear.
Objetivo do Estudo
- Registrar a atividade pós-sináptica em sinapses aferentes de células ciliadas internas.
- Demonstrar a técnica de patch-clamp no modo de célula inteira em um modelo de mamífero.
- Facilitar a aprendizagem da dissecação e preparo do tecido coclear.
Métodos Utilizados
- Dissecação do tecido coclear de uma rata decapitada.
- Preparação de uma lamínula modificada para estabilização do tecido.
- Uso de microeletrodos para acessar fibras aferentes.
- Registros de patch-clamp em configuração de célula inteira para medir atividade sináptica.
Resultados Principais
- Estabelecimento bem-sucedido da configuração de célula inteira na sinapse da célula ciliar interna.
- Gravação de potenciais pós-sinápticos de sinapses individuais com grânulos.
- Demonstração da eficácia do método na captura da atividade sináptica.
- Auxílios visuais aprimoraram a compreensão do processo de dissecação.
Conclusões
- O método fornece uma abordagem confiável para o estudo de sinapses auditivas.
- Os conhecimentos obtidos podem contribuir para a compreensão dos mecanismos de processamento auditivo.
- Demonstrações visuais são essenciais para dominar a técnica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a investigação eletrofisiológica direta de sinapses em fita única, fornecendo uma plataforma de alta resolução para o estudo da dinâmica da liberação de neurotransmissores em sistemas sensoriais. Ao registrar correntes pós-sinápticas de fibras aferentes individuais que fazem contato com células ciliadas internas, a abordagem possibilita a desmistificação mecanicista de modelos de transmissão sináptica relevantes para a validação de alvos em neurociência. A técnica oferece valor preditivo para avaliar os efeitos de compostos sobre a probabilidade de liberação pré-sináptica e a função de receptores pós-sinápticos em um sistema nativo e relevante para doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar os mecanismos de liberação multivesicular em uma sinapse definida, esclarecendo as contribuições pré-sinápticas para a neurotransmissão.
- Valor Operacional: Fornece leituras quantitativas da amplitude e da frequência da corrente pós-sináptica excitatória para avaliar a função pré-sináptica.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Valor Científico: Gera medições padronizadas e quantificáveis de correntes pós-sinápticas adequadas para o desenvolvimento de ensaios direcionados ao ciclo de vesículas sinápticas.
- Valor Operacional: Permite a detecção reprodutível de correntes pós-sinápticas excitatórias evocadas e espontâneas em diferentes preparações.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona a entrada de cálcio pré-sináptica com a ativação da corrente pós-sináptica, permitindo a redução de riscos dos efeitos de moduladores de canais de cálcio na transmissão sináptica.
- Valor Operacional: Facilita o monitoramento longitudinal da estabilidade sináptica e da depressão durante estimulações repetidas, apoiando a validação de modelos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere em fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir a medição direta da transmissão sináptica em uma sinapse em fita definida, fornecendo informações sobre o engajamento do alvo e estudos do mecanismo de ação antes da otimização do composto líder.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre mecanismos de liberação pré-sináptica e respostas de receptores pós-sinápticos utilizando gravações de patch-clamp em célula inteira.
- Triagem: Fornece leituras reprodutíveis e quantificáveis de correntes pós-sinápticas excitatórias para avaliar os efeitos de compostos na liberação de vesículas sinápticas.
- Análises: Oferece distribuições de amplitude e frequência das correntes pós-sinápticas excitatórias como métricas quantitativas para comparar condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta a despolarização das células ciliadas internas à ativação de fibras aferentes, modelando uma via de transdução sensorial nativa relevante para alvos de perda auditiva.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma eletrofisiológica padronizada para testes iterativos de moduladores sinápticos em múltiplas rodadas experimentais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Permite a desvinculação mecanicista de modelos de transmissão sináptica por meio da observação direta de eventos de liberação multivesicular.
- Valor Operacional: Fornece gravações com alta resolução temporal e variabilidade mínima de preparação devido a métodos padronizados de estabilização de microeletrodos e tecidos.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de avançar/não avançar ao reduzir a incerteza na validação de alvos pré-sinápticos por meio de leituras funcionais diretas.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de compostos que visam proteínas de vesículas sinápticas ou canais de cálcio com base em respostas pós-sinápticas validadas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação coclear, preparação de microeletrodos e eletrofisiologia por grampo de tensão em célula inteira.
- Depende de microeletrodos de alta qualidade com diâmetros de ponta submicrométricos e preparações de tecido estabilizadas utilizando lamínulas modificadas.
- Necessita de soluções extracelulares e intracelulares padronizadas para garantir gravações consistentes de correntes pós-sinápticas.
- Envolve adaptações entre espécies ou modelos de idade que podem afetar a acessibilidade das fibras aferentes e as propriedades sinápticas.
- Limitado pelo desafio técnico de manter a estabilidade de longo prazo da configuração de célula inteira da fibra aferente durante gravações prolongadas.
