Name: Gravações pós-sinápticos em Dendrites aferente entrar em contato com células ciliadas da cóclea: Release multivesiculares Monitoramento em uma fita Synapse (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-10T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Aprenda a realizar registros de patch-clamp em dendritos de fibras auditivas em sinapses de células ciliadas internas de cochlea de mamíferos. Este método permite capturar atividade pós-sináptica e estudar processamento auditivo.

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Este trabalho foi financiado por um Surdez Research Foundation Research Grant para EY e NIDCD DC006476 para EG e por NIDCD DC005211 com o Centro de Audição e Equilíbrio, Johns Hopkins University. Arte copyright Tim Phelps, Johns Hopkins University. LG escreveu o manuscrito inicial; EY e LG filmado na dissecção e na gravação. Todos os autores forneceram valores exemplar e contribuiu para escrever o manuscrito.

<ol><li>Glowatzki, E., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmitter+release+at+the+hair+cell+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transmitter release at the hair cell ribbon synapse.</a> Nat Neurosci. 5 (2), 147-154 (2002).</li>
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<li>Suryanarayanan, A., Slaughter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+transmission+mediated+by+internal+calcium+stores+in+rod+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic transmission mediated by internal calcium stores in rod photoreceptors.</a> J Neurosci. 26 (6), 1759-1766 (2006).</li>
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<li>Tritsch, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+spontaneous+activity+in+the+developing+auditory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The origin of spontaneous activity in the developing auditory system.</a> Nature. 450 (7166), 50-55 (2007).</li>
<li>Kros, C. J., Ruppersberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+potassium+current+in+inner+hair+cells+during+development+of+hearing+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expression of a potassium current in inner hair cells during development of hearing in mice.</a> Nature. 394 (6690), 281-284 (1998).</li>
<li>Muller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+of+frequency+representation+in+the+rat+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Developmental changes of frequency representation in the rat cochlea.</a> Hear Res. 56 (1-2), 1-7 (1991).</li>
<li>Seal, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorineural+deafness+and+seizures+in+mice+lacking+vesicular+glutamate+transporter+3%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3.</a> Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O passo crítico neste procedimento é a dissecção. Se o tecido é esticado ou danificados durante a dissecção, fibras aferentes não vai sobreviver. Tecidos de ratos mais jovens é mais elástica e de perdão. Nós encontramos que os dias pós-natal 10-11 são os mais fáceis de dissecar e experimentos têm maiores taxas de sucesso. Um grau significativo de maturação coclear ocorre após o nascimento, com os ratos começam a ouvir de todo dia pós-natal 12 14. Portanto, na idade em que a dissecção é mais fácil, as sinapses podem não ser totalmente maduro 4. A dissecção descrita aqui para ratos é essencialmente o mesmo para os ratos, a principal diferença é o tamanho menor da cóclea do rato. Esta técnica permite que as propriedades de sinapses fita para ser examinado em camundongos modificados transgenicamente 15. Alterações posteriores a esta técnica são: a adição de um corante fluorescente para a solução intracelular para fibras rótulo 3; gravações emparelhado com o pré-sináptica das células ciliadas internas e bouton aferentes pós-sináptica, permitindo que a função de transferência entre pré e pós-sináptica de células a ser determinado 2 e loose- selo gravações extracelular em boutons aferentes para evitar a perda da integridade celular. A configuração de gravação extracelular é mais fácil de atingir do que toda a configuração de células e experimentos são geralmente mais duradouros.

Acima é o equipamento em nosso setups eletrofisiológico utilizado para a gravação dos terminais aferentes.

gravações pós-sinápticos em dendrites aferente entrar em contato com células ciliadas da cóclea: release multivesiculares monitoramento em uma fita synapse

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

A sinapse aferente entre a célula ciliadas internas (CCI) e da fibra do nervo auditivo fornece um site eletrofisiologicamente acessível para a gravação da atividade pós-sináptica de uma fita única sinapse 1-4. Sinapses fita de células sensoriais liberação de neurotransmissores de forma contínua, cuja taxa é modulada em resposta a mudanças graduais em IHC potencial de membrana 5. Sinapses fita foram mostrados a funcionar pelo lançamento multivesiculares, onde múltiplas vesículas pode ser lançado simultaneamente para evocar correntes excitatórias pós-sináptico (EPSCs), com diferentes amplitudes 1, 4, 6-11. Nem o papel da fita pré-sináptico, nem o mecanismo subjacente liberação multivesiculares está bem compreendida. O IHC é inervado por fibras do nervo auditivo 10-20, e todos os contatos de fibra da IHC com um único unmyelinated fim para formar uma fita única sinapse. O pequeno tamanho da IHCS aferentes boutons entrar em contato com (aproximadamente 1 m de diâmetro) permite gravações com resolução temporal excepcional para ser feita. Além disso, a técnica pode ser adaptada para gravar a partir de ambas as células pré e pós-sinápticos simultaneamente, permitindo que a função de transferência na sinapse a ser estudada diretamente 2. Este método, portanto, fornece um meio pelo qual os aspectos fundamentais da neurotransmissão pode ser estudada, de liberação multivesiculares para a função de esquiva da fita em células sensoriais.

Whole-cell patch-clamp gravações de dendritos do nervo auditivo fibra no interior da fita sinapse das células ciliadas da cóclea de mamíferos.

Gravações pós-sinápticos em Dendrites aferente entrar em contato com células ciliadas da cóclea: Release multivesiculares Monitoramento em uma fita Synapse

A sinapse aferente entre a célula ciliada interna (CCI) e a fibra do nervo auditivo fornece um local eletrofisiologicamente acessível para o registro do...

O objetivo geral deste procedimento é registrar a atividade pós-sináptica em sinapses aferentes de células ciliadas internas. Isso é realizado primeiramente expondo o epitélio sensorial de uma cóclea recentemente removida de um rato decapitado. O segundo passo do procedimento consiste em posicionar a volta apical excisada sobre uma lamínula modificada e transferi-la para a câmara de registro.O terceiro passo do procedimento é localizar e obter acesso a um bastão aferente com um eletrodo de gravação. O passo final do procedimento é formar um selo apertado sobre a membrana da fibra aferente e, em seguida, rompê-la, estabelecendo a configuração de célula inteira da técnica de patch clamp. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a ocorrência pós-sináptica ou potenciais provenientes de uma única sinapse em fita por meio da eletrofisiologia de patch clamp em configuração de célula inteira.A demonstração visual deste método é essencial, pois o dissecção e o preparo do tecido coclear são difíceis de aprender, e as pequenas fibras aferentes são difíceis de reconhecer e acessar. Antes de iniciar a dissecção, prepare uma lamínula modificada que manterá o preparo no lugar durante as gravações. Usando uma lamínula circular de vidro com oito a 12 milímetros, aplique uma gota de Sylgard semicurado próximo à borda da lamínula.Coloque a extremidade grossa de um alfinete fino para insetos sobre a lamínula. Segure o alfinete firmemente contra o vidro. Com pinça, aqueça a proteção da borda em uma bobina aquecida para fixá-la.Prepare 10 a 20 microeletrodos conforme descrito no texto acompanhante. Após o polimento com chama utilizando um microforjador, o microeletrodo deve apresentar um diâmetro externo da ponta de aproximadamente um mícron. A espessura final da parede da pipeta equivale a cerca de um terço de um micrômetro após a anestesia e decapitação de um rato com três semanas de idade.Inicie a dissecação removendo a pele ao dissecar a cabeça e retirar o cérebro. Para expor o osso temporal, remova ambos os ossos temporais. Coloque cada osso temporal em um recipiente de dissecação limpo contendo solução extracelular padrão. O próximo passo é remover o osso que envolve o osso temporal, de modo a expor a cóclea.Segure firmemente o osso temporal na base com um par de pin&ccedil;as. Identifique a janela redonda e a janela oval e a c&oacute;clea. Oriente a c&oacute;clea de modo que a janela oval e o lado espiralado da c&oacute;clea fiquem voltados para cima.Remova o excesso de osso ao redor da cóclea. Use um segundo par de pinças finas para quebrar o osso diretamente da cóclea, começando pela área que é mais transparente que o restante do osso. Nessa região, o osso é mais fino e mais fácil de remover.Continue removendo o osso ao redor da espiral apical. Use tesoura microcirúrgica para cortar o modiolo sob a volta apical. Em seguida, desconecte a volta apical das voltas inferiores da cóclea.Tenha cuidado para proteger a espiral apical. Ela não deve ser puxada ou esticada. Por fim, remova a volta apical da cóclea sem rasgar muito o tecido.Use pin&ccedil;as finas para remover o restante do osso. O pr&oacute;ximo passo &eacute; remover o STR dos oculis e a membrana tial. Remova cuidadosamente o STR dos oculis, a faixa brilhante de tecido situada externamente &agrave; regi&atilde;o das c&eacute;lulas ciliadas.Certifique-se de evitar a remoção das células ciliadas sensoriais, que podem facilmente se destacar junto com a membrana tectorial do ocelo. Em seguida, use pinças finas para destacar a membrana tectorial. A membrana semitransparente e brilhante que está localizada acima das células ciliadas sensoriais deve ter os tecidos e ossos em excesso removidos, e o preparo deve ser achatado com as pinças.Isso é necessário para que o tecido possa ser posicionado uniformemente sob um pino. A dissecação está agora concluída. Coloque o preparado sob o pino sobre a lamínula preparada, tomando cuidado para posicionar o pino longe das células ciliadas assim que a dissecação for concluída.Use uma pin&ccedil;a para transferir o preparo para a c&acirc;mara de registro, mantendo uma gota de fluido extracelular sobre o lam&iacute;nula que sustenta o tecido coclear, e imediatamente inicie a perfus&atilde;o com solu&ccedil;&atilde;o extracelular. Para garantir melhor sobrevida do preparo, utilize a objetiva de 10 x ou a objetiva de imers&atilde;o em &aacute;gua de 40 x com contraste de interfer&ecirc;ncia diferencial (DIC) do microsc&oacute;pio. Para localizar o preparo, posicione-o de modo que os eletrodos de registro possam se aproximar das c&eacute;lulas ciliadas internas em &acirc;ngulo reto em rela&ccedil;&atilde;o &agrave;s suas paredes laterais.Se a visibilidade da região basal das células ciliadas internas for limitada porque o preparado está encurvado, use um eletrodo de gravação para empurrar a borda externa do preparado contra a lamínula de vidro, tomando cuidado para evitar pressionar as próprias células ciliadas internas. Neste preparado, o eletrodo superior está segurando a borda externa do preparado, enquanto o eletrodo inferior marca a localização dos bastões aferentes.Para referência, a câmera NC 70 Nuv Con exibe na tela a imagem ampliada do Forex para avaliar se o tecido na região das células ciliadas internas está saudável. Localize os feixes ciliares como ponto de referência e foque para baixo até encontrar os núcleos. Continue focando mais abaixo em direção à base das células ciliadas internas, com suas terminações aferentes, e depois volte a focar para cima até atingir o nível dos núcleos no monitor.Agora localize os bastões aferentes ao redor da base das células ciliadas internas. Os bastões são esféricos ou elipsoidais, com aproximadamente um mícron de diâmetro, e apresentam cor clara com aparência brilhante. Você os encontrará ao focar para cima e para baixo.O próximo passo é abrir um caminho até as fibras aferentes utilizando um eletrodo de gravação com ponta de um mícron preenchida com solução intracelular. Aplique pressão positiva e use o micromanipulador para movimentar o eletrodo até o preparado. Utilize este eletrodo para fazer uma incisão no preparado ao nível da base das células ciliadas internas.Empurre o eletrodo entre a camada fina de células de suporte e as células ciliadas internas usando pressão positiva para abrir uma rota de acesso até a região na base das células ciliadas internas. Remova cuidadosamente o eletrodo e substitua-o por um eletrodo novo com ponta de diâmetro de um mícron preenchida com solução intracelular. Usando pressão positiva para manter a ponta do eletrodo limpa, mova o eletrodo de registro através do orifício de acesso, contornando as células de suporte adjacentes, em direção ao bastão aferente.Certifique-se de que a ponta do eletrodo esteja diretamente em frente ao batão aferente. Os batões oferecem maior resistência ao movimento da pipeta do que as células de suporte e a membrana da célula ciliar interna. Essa diferença pode ser sentida ao mover a pipeta; mova-a para cima e para baixo e empurre para verificar se o batão se move. Isso indica que a ponta da pipeta e o batão estão no mesmo plano de foco, com o eletrodo pressionado contra o batão aferente. Simultaneamente, libere a pressão positiva e aplique sucção para formar um selo de giga ohm.Aplique suaves rajadas de sucção para romper a membrana dentro do eletrodo e obter um registro em modo de célula inteira. Se a célula selada for um bastão aferente, pequenos transientes capacitivos são observados no modo de registro de célula inteira. Esta figura mostra um transiente típico registrado de uma fibra aferente.Inicie a gravação da atividade sináptica. Se a fibra aferente não exibir atividade espontânea, despolarize a célula ciliar aplicando uma solução extracelular com uma concentração mais elevada de potássio. Esta figura mostra as relações típicas entre corrente e voltagem para fibras AFF à esquerda e células ciliadas internas à direita.As relações corrente-tensão foram registradas a um potencial de retenção de menos 84 milivolts, com incrementos de tensão de menos 124 milivolts a mais 36 milivolts em passos de 10 milivolts. As tensões são mostradas à direita de alguns traçados, enfocando as relações corrente-tensão de uma fibra aferente. Observe que as ocorrências excitatórias pós-sinápticas, ou EPCs, estão presentes durante a maior parte dos passos de tensão.Os PCEs inverteram um potencial positivo em cerca de seis milivolts positivos. Esta gravação foi realizada na presença de tetrodotoxina para bloquear as correntes de sódio dependentes de voltagem; sem o bloqueador, correntes internas de sódio de ativação rápida também teriam aparecido na gravação e identificado a gravação como proveniente de uma fibra aferente. Observe a corrente interna de ativação lenta em voltagens hiperpolarizantes.Essa corrente não está presente nas células ciliadas internas nem nas células de suporte e fornece uma boa indicação de que a gravação é proveniente de uma fibra aferente. Essas gravações mostram as relações corrente-tensão para uma célula ciliada interna. A seta aponta para as correntes de potássio para fora de ativação rápida em potenciais positivos.Esses são seguidos por correntes de potássio retificadoras tardias devido a um diâmetro estreito da pipeta e alta resistência de acesso. As correntes das células ciliadas internas mostradas aqui são menores do que o esperado para obter gravações precisas das correntes das células ciliadas internas. Devem ser utilizadas pipetas com resistências de acesso mais baixas.No entanto, as gravações apresentadas aqui demonstram que as relações corrente-tensão de células ciliadas internas e fibras aferentes podem ser claramente diferenciadas. Esta figura mostra correntes sinápticas registradas de uma fibra aferente. Observe o tamanho e a forma variáveis dos EPCs.Os registros foram realizados à temperatura ambiente com tetratoína aplicada para bloquear as correntes de sódio dependentes de voltagem. Esta figura mostra registros simultâneos de uma célula ciliar interna e de um bastão aferente em contato. Um degrau de voltagem foi utilizado para despolarizar a célula ciliar interna e, em resposta, foram registradas correntes de cálcio para dentro; a entrada de cálcio na célula ciliar interna resulta na liberação de neurotransmissores e na ativação de correntes pós-sinápticas excitatórias (EPCs) no bastão aferente.Observe que a depressão sináptica aparece durante uma despolarização de 50 milissegundos da célula ciliar interna ao realizar este procedimento. É importante lembrar-se de ter cuidado ao dissecar e preparar o tecido coclear e manter-se paciente e otimista ao tentar registrar os terminais aferentes.

postsynaptic-recordings-at-afferent-dendrites-contacting-cochlear

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aqui nós descrevemos um protocolo para a preparação de agar-embedded fatias da retina que são adequados para eletrofisiologia e Ca2 + imagem. Este método permite que um estudo de fita do tipo sinapses em microcircuitos da retina usando direto de patch-clamp gravações de um único terminais nervosos pré-sinápticos.

Patch-clamp medidas de capacitância e Ca 2 + Imaging nos terminais nervosos da retina único em Fatias

Este vídeo demonstra a gravação combinada da saída aferente mecanicamente estimulada e da marcação do terminal nervoso nos folículos pilosos de um pavilhão auricular de camundongo. Ele descreve as etapas envolvidas na estimulação mecânica dos terminais nervosos do folículo piloso antes e depois da exposição a um corante de membrana fluorescente, registro eletrofisiológico dos potenciais de ação gerados e visualização da rotulagem do terminal nervoso nos folículos pilosos.

Registro combinado de saída aferente mecanicamente estimulada e marcação de terminais nervosos em folículos pilosos de camundongos

Este vídeo demonstra um método para avaliar sinapses de fita em regiões específicas da cóclea do camundongo. Ele utiliza técnicas de imunocoloração e imagem confocal para identificar sinapses funcionais em diferentes regiões de frequência em cada giro coclear.

Avaliação de sinapses de fita em regiões de frequência específicas da cóclea de camundongo

É apresentada uma técnica simples e inovadora para registrar a descarga aferente devido à estimulação mecânica dos terminais lanceolados das terminações paliçadas que inervam os folículos pilosos da pele da orelha do camundongo.

Gravação combinado de saída Mecanicamente Stimulated aferentes e Nerve Terminal Rotulagem no mouse do folículo piloso Lanceolate Endings

Correntes sinápticas podem ser gravadas focally de boutons sinápticas visualizados na drosófila terceiro ínstar larvas junção neuromuscular. Esta técnica permite monitorar a atividade de um único bouton sináptica.

Macropatch focal gravações das correntes sinápticas da junção Neuromuscular Larval da drosófila

Este protocolo descreve métodos para gravar a resposta auditiva do tronco encefálico de filhotes pós-natal. Para examinar o desenvolvimento funcional de células exteriores do cabelo, o procedimento experimental da braçadeira do remendo de células inteiras gravação em células isoladas de cabelo exteriores é descrito passo a passo.

Auditivo de tronco encefálico e exterior cabelo célula célula inteira Patch Clamp gravação em ratos pós-natal

Este manuscrito descreve um protocolo experimental para avaliar as características morfológicas e o estado funcional das sinapses da fita em camundongos normais. O modelo atual é igualmente apropriado para modelos synaptopathy-restringidos ruído-induzidos e idade-relacionados da coclear. Os resultados correlativos de estudos precedentes do rato são discutidos igualmente.

Avaliação morfológica e funcional de sinapses de fita em regiões de frequência específica da cóclea do rato

Aqui, apresentamos um método para visualizar a captação de 3 kDa Texas Red-labeled dextran em células ciliadas auditivas com canais funcionais de mecanotransdução. Além disso, a dextrans de 3 a 10 kDa pode ser usada para estudar endocitose em cabelos e células de apoio do órgão de Corti.

Etiquetagem Dextran e Captação em Células Capilares Murina Coclear

Um protocolo para processar a cópula gerbil jovem e envelhecida imunolabelando as estruturas sinápticas e células ciliadas anciavelmente, saciando a autofluorescência no tecido envelhecido, dissecando e estimando o comprimento da cóclea, e quantificando as sinapses em pilhas de imagens obtidas com imagens confocalas.

Sinpses de fita de imunolabeling e contagem em jovens adultos e cócleas de Gerbil Envelhecido

São apresentados métodos que fornecem instruções detalhadas para dissecar, dissociar, cultivar e registrar patch-clamp dos neurônios do gânglio vestibular e do gânglio espiral da orelha interna.

Isolamento e Cultivo de Somatas Vestibulares e Gangliões Espirais de Roedores Neonatais para Gravações de Patch-Clamp

Aprenda a realizar registros de patch-clamp em dendritos de fibras auditivas em sinapses de células ciliadas internas de cochlea de mamíferos. Este método permite capturar atividade pós-sináptica e estudar processamento auditivo.

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