Geração de Esferoplastos a partir de Bactérias Gram-Negativas

Pegue mídia contendo um antibiótico que bloqueia a divisão celular.

Inocule-o com bactérias Gram-negativas em forma de bastonete.

Incube com sacudimento.

Na presença do antibiótico, as bactérias continuam crescendo sem se dividir e formam filamentos longos.

Recolha a cultura e centrifuge-a em baixa temperatura. Descarte o sobrenadante e lave os filamentos com uma solução de sacarose para evitar a lise.

Descarte a solução de sacarose.

Adicione um tampão seguido de enzimas e EDTA. O EDTA enfraquece a membrana externa, permitindo que a lisozima entre e decomponha a camada de peptidoglicano.

Isso remove a parede celular, permitindo que a célula bacteriana encolha. A DNase I quebra o DNA cromossômico liberado das células e impede o agrupamento celular.

Adicione uma solução hipotônica com um movimento suave, permitindo que a célula absorva água.

As membranas flexíveis permitem que a célula assuma uma forma esférica chamada esferoplasto.

Transfira uma alíquota contendo os esferoplastos em dois tubos com uma solução isotônica resfriada para estabilizar os esferoplastos.

Para preparar esferoplastos Gram-negativos de E. coli, dilua a cultura durante a noite em uma proporção de 1 a 100 em 25 mililitros