Quantificação da Supressão de Biofilme Induzida por Enzimas em Bactérias Patógenas

Pegue uma microplaca contendo poços de controle e tratamento, cada um inoculado com uma bactéria patogênica formadora de biofilmes.

Os poços de tratamento contêm uma enzima que interrompe a formação de biofilmes.

Incubar sob condições microanaeróbicas para criar um ambiente com baixo teor de oxigênio. Isso promove a secreção de moléculas de sinalização bacteriana que mediam a adesão da superfície. Nos poços de tratamento, a enzima degrada essas moléculas, reduzindo assim a ligação bacteriana.

Lave os poços para remover células não aderentes.

Introduza um meio fresco e incube. As bactérias aderidas proliferam e secretam substâncias poliméricas extracelulares, que formam a matriz de biofilmes.

Remova o meio e lave os poços.

Adicione um corante catiônico e incube para permitir a ligação a componentes de biofilme carregados negativamente.

Lave para remover o corante que não está ligado.

Incube com um solvente sob agitação para liberar o corante ligado na solução.

Meça a densidade óptica ou OD para quantificar a biomassa do biofilme.

A menor OD nos poços de tratamento reflete a redução da formação de biofilmes, resultante da adesão celular inicial comprometida.

Para começar, cultive uma cultura de 5 mililitros de A. baumannii S1 em LB a 30 graus Celsius em uma incubadora agitada por 16 horas.

Ajuste a cultura para um OD₆₀₀ de 0,8. Depois, use LB fresco contendo 4 miligramas por mililitro de enzima GKL purificada para diluir a cultura de 1 a 100. E adicione 100 microlitros aos poços de uma placa de 96 poços.

Use as tampas para cobrir os pratos e coloque-os em um recipiente plástico de 10 litros. Feche o recipiente e incube a 30 graus Celsius por três horas antes de remover o meio com cuidado. Adicione mais 100 microlitros de meio LB fresco aos poços e incube a placa a 30 graus Celsius por 21 horas.

Após remover suavemente o meio, use 200 microlitros de água estéril para lavar delicadamente as células das bactérias planctônicas. Posicione a ponta da pipeta no fundo do poço e remova cuidadosamente o meio líquido para garantir o mínimo de perturbações no biofilme estranho entre a interface do ar e do líquido. Depois, adicione 100 microlitros de solução de violeta cristalina a 1% em cada poço e incube por 15 minutos em temperatura ambiente.

Remova a solução de violeta cristalina usando 200 microlitros de água estéril para lavar os poços três vezes. Adicione 100 microlitros de ácido acético a 33% em cada poço e incube com uma agitação suave por 15 minutos para dissolver o corante. Quantifique a quantidade de biofilme medindo a absorção do violeta cristalino a 600 nanômetros. A quantidade de violeta cristalina é proporcional à quantidade de biofilme formado.