Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 3:47 min. • February 26th, 2026
Comece com dois micro-pratos de fundo de vidro contendo suspensões de uma bactéria formadora de biofilmes.
O prato de tratamento contém uma enzima ativa que perturba a sinalização, enquanto o controle inclui a enzima inativada.
Cubra os pratos e incube para permitir a adesão bacteriana à superfície do microprato.
Lave para remover células não aderentes, depois introduza um meio fresco contendo as enzimas e incube.
No prato de controle, as bactérias se comunicam por meio de moléculas sinalizadoras e produzem substâncias poliméricas extracelulares (EPS), formando um biofilme.
A enzima ativa degrada as moléculas sinalizadoras, prejudicando sua função e reduzindo a formação de biofilmes.
Reabasteça com meio fresco e incube ainda mais para reforçar os efeitos disruptivos do biofilme da enzima.
Remova o meio, adicione lectinas marcadas com fluorescência e incube para permitir a ligação da lectina ao EPS.
Lave para remover qualquer lectina solta.
Incube com um fixador para preservar a arquitetura do biofilme, depois enxágue o prato.
Adquira imagens de microscopia confocal para avaliar a supressão mediada por enzimas da formação de biofilmes.
Para realizar microscopia de varredura a laser confocal, ou CLSM, dos biofilmes S1 de A. baumannii , cultive uma cultura de 5 mililitros de A. baumannii S1 em LB a 30 graus Celsius em uma incubadora agitada por 16 horas. Ajuste a cultura de A. baumannii S1 para um OD600 de 0,8.
Depois, use LB fresco contendo 1,2 miligramas por mililitro de enzima GKL purificada para diluir a cultura, de 1 a 100, e adicione 1 mililitro a um microprato de 35 mililitros com fundo de vidro. Cubra o microprato com uma tampa e coloque-o em um recipiente plástico de 10 litros e sele antes de incubar o recipiente a 30 graus Celsius por três horas. Após remover suavemente o meio, adicione 1 mililitro de meio fresco contendo 30 microlitros de enzima GKL purificada e, em seguida, incube a 30 graus Celsius por mais 21 horas.
Remova suavemente o meio uma segunda vez e substitua por mais 1 mililitro de enzima GKL em meio fresco. Incube a 30 graus Celsius por 24 horas. Após a incubação, remova suavemente o meio e adicione 500 microlitros de 5 microgramas por mililitro de aglutinina conjugada do germe de trigo Alexa Fluor 488 dissolvida em HBSS.
Incube o microprato a 37 graus Celsius por 30 minutos para tingir os biofilmes. Para fixar os biofilmes, adicione 500 microlitros de formaldeído a 3,7% dissolvido em HBSS e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Use 2 mililitros de HBSS para lavar o microprato uma vez, depois remova completamente a solução.
Guarde o prato no escuro a 4 graus Celsius antes da imagem do CLSM. Para imagens e análises CLSM, use um objetivo de 63 X para gerar 97 pilhas por imagem, com um intervalo de 0,21 micrômetros por pilha.