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Comece com um dispositivo microfluídico montado em um palco de microscópio.
O dispositivo é composto por um conjunto de polímero e vidro que envolve um microcanal com pilares cilíndricos que imitam um meio poroso.
Uma bomba de seringa entrega o meio de cultura através de uma seringa instalada com filtro no canal, que drena por um tubo de saída para um recipiente de resíduos.
Monitore a pressão de base do fluido usando um sensor conectado ao canal.
Coloque o tubo de saída em um frasco contendo uma suspensão bacteriana.
Inverta o fluxo até que a suspensão preencha o canal, enquanto o filtro impede que bactérias entrem na seringa.
Incubar para permitir que as células bacterianas aderam às superfícies, proliferem e iniciem a formação de biofilmes.
Depois, remova o filtro e retorne a saída ao recipiente de resíduos.
Retome o fluxo do meio e monitore a pressão à medida que o biofilme cresce e bloqueia o canal.
Capture imagens microscópicas em time-lapse para visualizar o crescimento do biofilme ao longo do tempo. Correlacione o crescimento do biofilme com mudanças de pressão para estudar o bioentupimento em meios porosos.
Comece ligando a incubadora de caixa do microscópio três horas antes do experimento para garantir uma temperatura estável de 25 graus Celsius.
Conecte os tubos de entrada e saída ao dispositivo microfluídico. Assegure a conexão entre o tubo e a seringa inserindo uma agulha com diâmetro externo de 0,6 milímetros no tubo de entrada. Coloque o dispositivo microfluídico, 30 mililitros de água desionizada e 30 mililitros de meio de cultivo em um dessecador a vácuo e desgaseine-os por pelo menos uma hora.
Depois de terminar, puxe lentamente o meio de cultura e a água deionizada para duas seringas separadas de 30 mililitros. Depois, monte o dispositivo microfluídico no microscópio e coloque o tubo de saída em um recipiente de resíduos. Conecte a seringa cheia de água desionizada ao canal microfluídico através do tubo microfluídico e injete lentamente a água até que ela saia pela saída do sensor de pressão.
Encha o sensor de pressão com água e lave todas as bolhas do tubo que conecta o canal microfluídico ao sensor de pressão. Feche a saída do sensor de pressão com os parafusos dedicados ao sensor de pressão. Preencha o restante do canal microfluídico com água desionizada.
Em seguida, coloque um filtro de 1,2 micrômetro na seringa do meio de cultura. Remova a seringa de água e conecte cuidadosamente a seringa ao tubo microfluídico de entrada. Após montar a seringa na bomba da seringa, lave o canal com o meio de cultura a uma vazão de dois mililitros por hora durante uma hora.
Em seguida, ajuste a bomba de seringa para a vazão desejada durante o experimento e ajuste a leitura de pressão dos sensores de pressão para zero. Em seguida, pipete 1 mililitro da cultura Bacillus subtilis NCIB 3610 com densidade óptica de 0,1 em um comprimento de onda de 600 nanômetros em um frasco de centrífuga de 1,5 mililitro. Para carregar a cultura bacteriana no canal microfluídico, coloque o tubo de saída no frasco da centrífuga e espere cinco minutos para remover possíveis bolhas de ar da saída do tubo.
Após isso, retire 150 microlitros de solução bacteriana com uma vazão de 1 mililitro por hora até que o canal microfluídico esteja preenchido com a cultura bacteriana. Depois, remova cuidadosamente o filtro de seringa do meio de cultura e coloque a saída no recipiente de resíduos. Deixe as células bacterianas em condições de fluxo zero no canal microfluídico por três horas para permitir sua fixação superficial no meio poroso.
Para iniciar o experimento, inicie o fluxo ajustando a bomba da seringa para a vazão desejada e inicie a leitura de pressão em 1 hertz antes de adquirir as imagens dos biofilmes em crescimento no intervalo de tempo, configuração óptica e ampliação desejados.