Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 2:43 min. • March 31st, 2026
Comece com um rim de camundongo infectado com bactérias Gram-positivas modificadas que colonizam o tecido e formam lesões.
Todas as células bacterianas expressam fluorescência vermelha, enquanto condições específicas de lesão permitem a expressão de proteínas fluorescentes verdes em células específicas.
Trate o rim com um fixador e incube no escuro para preservar a estrutura do tecido e permeabilizar parcialmente as membranas celulares.
Infundi o órgão em um meio adequado, congele-o e divida-o em fatias finas de tecido.
Coloque a fatia sobre uma lâmina de vidro carregada para que fique aderente.
Tinga o tecido com um corante nuclear.
O corante penetra nas células do hospedeiro e bacterianas e se liga ao DNA.
Coloque uma cobertura sobre o tecido e observe a lâmina sob um microscópio de fluorescência usando canais de imagem específicos.
A coloração nuclear delimita o DNA hospedeiro e bacteriano.
Todas as bactérias no tecido expressam fluorescência vermelha, enquanto a expressão de fluorescência verde indica o local da interação hospedeiro-patógeno.
No ponto experimental apropriado, colhe rim, coração, fígado, pulmões e baço em tubos de polipropileno de 15 mililitros contendo 10% de formalina tamponada para uma incubação de 24 a 48 horas no escuro, em temperatura ambiente, com suave agitação ou rotação.
Ao final da fixação, infundir os órgãos em meio congelante de tecido transparente para armazenamento a menos 80 graus Celsius. Use um criostato para adquirir seções de tecido com 10 micrômetros de espessura e sece as seções em lâminas de vidro carregadas pré-limpas e pré-limpas por 20 minutos no escuro antes de aplicar um meio de montagem duro suplementado com DAPI. Depois, aplique as lâminas de cobertura e cure as lâminas em temperatura ambiente durante a noite antes de transferir as amostras para armazenamento de longo prazo a 4 graus Celsius.
Para identificar lesões nas amostras, coloque uma lâmina no palco de um microscópio confocal de varredura a laser e utilize um objetivo apropriado para visualizar células individuais e adquirir imagens das lesões.