Ensaio de Resistência ao Etanol para Avaliar a Integridade da Matriz de Biofilme

Veja biofilmes patogênicos derivados de bactérias cultivados em ágar nutritivo.

O biofilme não tratado apresenta bactérias densamente compactadas dentro de uma matriz extracelular protetora.

O biofilme tratado com inibidor apresenta células frouxamente associadas dentro de uma matriz esparsa.

Divida cada biofilme, depois expõe uma metade ao buffer como controle e a outra metade ao etanol para impor estresse antimicrobiano.

No biofilme não tratado e exposto ao etanol, a matriz densa reduz a difusão do etanol e limita a penetração celular, resultando em menos eliminação bacteriana.

No biofilme exposto ao etanol, tratado com inibidores, a matriz esparsa permite que o etanol penetre mais facilmente, levando a maior eliminação bacteriana.

Centrifuge os tubos e remova o sobrenadante. Adicione buffer e sonice para dispersar as células.

Placar as suspensões diluídas e incubar para permitir o crescimento de bactérias viáveis.

Contar unidades formadoras de colônias (CFUs); menos CFUs do biofilme exposto ao etanol tratado com inibidores confirmam que a integridade da matriz é essencial para a resistência ao etanol.

Pegue uma lâmina de barbear limpa e corte as colônias de biofilme em duas partes iguais com a ajuda do mole. Levante cuidadosamente metade da colônia com uma espátula limpa e transfira-a para um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros, contendo 500 microlitros de PBS.

Pegue a segunda metade da colônia e transfira-a para um tubo microcentrífuga contendo 500 microlitros de 50% de etanol. Esses serão usados para avaliar a resistência a agentes esterilizantes. Depois, de forma semelhante, pegue a primeira metade da colônia tratada com D-leucina e coloque-a no PBS.

Depois, pegue a segunda metade dessa colônia e transfira para etanol. Incube todos os tubos contendo as metades do biofilme por 10 minutos em temperatura ambiente. E então, centrifuge-as por cinco minutos a 18.000 vezes g.

Usando uma pipeta, remova cuidadosamente o sobrenadante. Adicione 300 microlitros de PBS e depois sonice as células em uma configuração baixa, com um sonicador microponta. Adicione mais 700 microlitros de PBS para um volume final de um mililitro.

Em seguida, realize uma diluição serial de 10 elevado ao menos sete no PBS. Pegue 100 microlitros de uma das diluções e inocule uma placa LB de ágar com 1,5%. Repita essa etapa para outras duas diluições por amostra.

Espalhe o inóculo usando contas de vidro e depois incube as placas durante a noite a 30 graus Celsius. Examine as placas e conte as unidades formadoras de colônias, ou CFU. Após calcular o valor da CFU por mililitro, calcule a porcentagem de sobreviventes no PBS versus tratamentos com etanol.