Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 2:32 min. • February 26th, 2026
Incubar um coverglass com câmara contendo bactérias aderidas em um meio suplementado com filtrado de escarro derivado do paciente e apenas no meio.
O filtrado de escarro contém componentes derivados do hospedeiro que estimulam vias de sinalização bacteriana, desencadeando a produção de matrizes e a formação de biofilmes.
Uma vez formados os biofilmes, descarte o meio que contém bactérias flutuantes e componentes residuais derivados do hospedeiro.
Lave com um tampão para remover bactérias frouxamente presas.
Adicione uma mistura de coloração contendo corantes fluorescentes permeáveis e impermeáveis à membrana, e incube no escuro.
O corante permeável à membrana cruza membranas intactas, marcando bactérias viáveis e não viáveis. Em contraste, o corante impermeável entra apenas nas membranas danificadas, marcando seletivamente bactérias não viáveis.
Após a incubação, remova a solução de tingimento e lave com o tampão para eliminar o excesso de corante e reduzir a fluorescência de fundo.
Adicione um novo meio e adquira imagens usando microscopia confocal.
Biofilmos cultivados com filtrado de escarro exibem espessura aumentada, destacando o papel dos componentes derivados do hospedeiro na formação de biofilmes.
Após o crescimento, retire o meio dos poços da câmara e lave suavemente cada câmara duas vezes com 300 microlitros de PBS estéril.
Em seguida, para preparar a mistura de coloração de biofilme, adicione 1 micrólitro de cada corante fornecido no kit de viabilidade a cada mililitro de solução necessário e misture a solução.
A quantidade ótima de corante e o tempo de coloração são determinados empiricamente para cada organismo.
Adicione 200 microlitros da mistura de tingimento a cada poço do vidro de cobertura com câmara. Incube o vidro da cobertura.
Após a incubação, remova a mistura de coloração das câmaras e lave cada poço com 300 microlitros de PBS estéril.
Substitua o PBS por mídia nova. Por fim, prossiga com a visualização via microscopia confocal.