Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 2:59 min. • March 31st, 2026
Comece com poços de microplacas contendo biofilmes de uma bactéria patogênica, divididos em quatro grupos experimentais.
Aspire suavemente o meio e enxágue com um tampão para remover células não aderentes.
Adicione um buffer contendo um precursor do fotosensimizador em dois grupos, enquanto os dois restantes recebem apenas o buffer.
Incube todos os grupos no escuro para permitir que o precursor difunda através do biofilme, entre nas células bacterianas e seja metabolizado em um fotosensimizador que se acumula no citoplasma e nas membranas.
Após a incubação, expõe um grupo tratado com precursor e um grupo apenas tampão à irradiação luminosa.
No grupo tratado por precursores, a luz excita o fotossensibilizador, que transfere energia para o oxigênio molecular e gera espécies reativas de oxigênio (ROS).
Os ROS desintegram membranas, degradam proteínas e fragmentam DNA, resultando na morte celular bacteriana.
As outras três condições não produzem ROS, pois o precursor ou a luz estão ausentes, deixando o biofilme inalterado.
Para gerar um biofilme em uma placa de 96 poços, primeiro inocule um a menos 80 graus Celsius descongelou Staphylococcus aureus USA trezentos em três biofilmes, formando culturas clínicas de cepas em tubos individuais de fundo redondo de 14 mililitros contendo cinco mililitros de caldo de soja de triptona, ou meio TSB, em uma incubadora a 37 graus Celsius com agitação durante a noite. Quando as culturas atingem a fase estacionária, centrifugar as células bacterianas e ressuspender os pellets e PBS até 2 vezes 10 à nona colônia, formando unidade por mililitro de concentração. Diluir essas suspensões bacterianas em uma proporção de 1 a 200 e um meio TSB suplementado com glicose zero vírgula cinco por cento e semear 200 microlitros de células bacterianas por poço em três poços por cepa por grupo experimental em uma microplaca de 96 poços tratada com cultura de poliestireno para uma incubação de 24 horas a 37 graus Celsius, com oxigênio, sem tremer.
No dia seguinte, lave suavemente os poços três vezes com PBS sem perturbar os biofilmes. Em seguida, adicione 200 microlitros de ALA recém-preparado aos poços experimentais apropriados e coloque a placa a 25 graus Celsius por uma hora protegida da luz. Depois, irradie a placa com um diodo emissor de luz a uma intensidade luminosa de 100 miliwatts por centímetro quadrado por uma hora.