Preparação de amostras e imagem de bactérias marcadas com fluorescência

Comece com uma lâmina de vidro grande e lâminas menores colocadas em cada borda em uma camada dupla.

Despeje agarose derretida no espaço e cubra com outra lâmina grande de vidro.

Resfrie a configuração para solidificar a agarose.

Remova os slides de vidro e corte a agarose em pequenas almofadas.

Coloque as almofadas de agarose dentro de uma moldura adesiva presa a um ferrolho.

Pegue uma cultura de bactérias patogênicas, geneticamente modificadas para expressar um sistema de secreção marcado fluorescente, essencial para a infecção do hospedeiro.

Use uma mancha bacteriana densa e suspenda-a em água.

Vórtice para dispersar as bactérias uniformemente.

Aplique a suspensão na almofada de agarose para imobilizar as bactérias.

Fele com uma capa de cobertura para manter a hidratação.

Sob iluminação de campo claro, selecione um campo de células para imagem.

Otimize as configurações do microscópio para reduzir o fotodescolorimento e aumentar a sensibilidade ao sinal.

Mude para o canal de fluorescência para detectar as bactérias marcadas com fluorescência.

Comece fazendo almofadas de agarose para imagens de células vivas. Prepare cerca de 30 mililitros de solução de agarose de baixa fusão a 1% em água e aqueça no micro-ondas em um frasco de vidro por cerca de 90 segundos, girando ocasionalmente até que a agarose esteja completamente dissolvida.

Coloque dois slides de vidro de 22 por 22 por 0,15 milímetros na borda de um slide de vidro de 25 por 75 por 1,1 milímetros, um sobre o outro. Depois, empilhe mais dois slides menores na outra borda. Pipete cerca de 1 mililitro da agarose fundida na lâmina central entre as duas lâminas superiores de vidro e coloque outra lâmina grande sobre a agarose derretida, garantindo a formação de bolhas de ar.

Resfrie os slides a quatro graus Celsius por 15 minutos e depois use um bisturi ou lâmina de barbear para cortar delicadamente a almofada em pequenos quadrados. Fixe uma moldura adesiva dupla face em um ferrolho de vidro de 25 por 75 por 1,1 milímetro e coloque várias almofadas no ferrolho. Dissolva uma mancha espessa de Legionella pneumophila em 1 mililitro de água duplamente destilada.

Depois, vórtice e pipete de 2 a 3 microlitros da diluição nas pastilhas. Coloque delicadamente uma cobertura de 58 por 24 por 0,15 milímetros sobre a estrutura adesiva. Selecione células para imagem usando iluminação em campo forte.

Depois, na janela de captura do software do microscópio, ajuste o ND para 180 e o binning para 2 por 2. Use o canal de 488 nanômetros para expor a amostra por 500 a 1000 milissegundos e valide a especificidade da fluorescência ao imagear Legionella pneumophila não marcada com os mesmos parâmetros.