Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 3:08 min. • March 31st, 2026
Comece com um camundongo cujo trato gastrointestinal é colonizado por Clostridium difficile, um patógeno bacteriano anaeróbio formador de esporos.
Irange o rato e permita que ele defece naturalmente em um tubo estéril pré-pesado.
Determine o peso líquido da amostra fecal subtraindo o peso do tubo vazio do peso total para preparar as diluições apropriadas.
Transfira a amostra para um ambiente anaeróbico para preservar a viabilidade da bactéria sensível ao oxigênio.
Adicione um buffer à amostra e a desregule mecanicamente para liberar seu conteúdo em suspensão.
Incubar para permitir que detritos maiores se depositem, retendo células bacterianas e esporos no sobrenadante.
Realize diluições seriadas do sobrenadante no buffer.
Coloque as diluições em substrato seletivo e incube sob condições anaeróbicas.
O meio promove a germinação dos esporos e o crescimento seletivo de Clostridium difficile enquanto inibe bactérias concorrentes, resultando em colônias distintas.
Conte as colônias para quantificar a carga de Clostridium difficile nas fezes e avalie a colonização gastrointestinal.
Para coletar amostras fecais de camundongos para avaliação, primeiro segure o camundongo levemente, mas firmemente, pela pele frouxa do pescoço e das costas, garantindo que o animal não esteja em sofrimento.
Usando o dedo mindinho, levante delicadamente a cauda do animal, expondo o ânus. Segure um tubo estéril de microcentrífuga de peso conhecido diretamente sob o ânus do animal, garantindo que o tubo não toque diretamente o rato. Quando o animal defecar, colete o pellet fecal no tubo.
Armazene o tubo em temperatura ambiente até que todas as amostras necessárias sejam coletadas. Pese os tubos contendo fezes em uma balança analítica e registre a massa até quatro casas decimais. Calcule o peso do pellet fecal subtraindo o peso do tubo.
Em seguida, calcule uma diluição de um a dez do conteúdo e resuspenda em 1x PBS. Use a ponta da pipeta para desorganizar suavemente a matéria fecal e transformar a solução. Incube as amostras em temperatura ambiente por 30 minutos, permitindo que o conteúdo se deposite.
Mantendo as soluções anaeróbicas, faça diluições seriadas para cada amostra em 1x PBS. Transfira 100 microlitros de cada diluição serial para placas TCCFA. Use um espalhador estéril em formato de L e aplique o substrato de forma uniforme nas placas.
Incube as placas em condições anaeróbias a 37 graus Celsius por 24 horas. Por fim, enumere as colônias de C. difficile e calcule a unidade formadora de colônias por grama de conteúdo fecal.