JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 3:03 min • March 31st, 2026
Pegue uma cultura bacteriana capaz de infectar tecido foliar.
Raspe as colônias e suspenda em uma solução salina.
Meça a densidade óptica para avaliar a concentração bacteriana e depois dilua até o OD desejado.
Realize diluições seriadas para atingir a concentração final do inoculo.
Adicione um surfactante para reduzir a tensão superficial e garantir a propagação uniforme das bactérias na folha.
Transfira a suspensão para uma placa de Petri.
Em seguida, coloque dois gravetos de madeira sobre o topo de um pote de Arabidopsis .
Inverta a planta sobre o prato, imergindo as folhas na suspensão.
Coloque a instalação em uma câmara de vácuo e aplique um pulso de vácuo
O vácuo aplicado remove o ar do tecido foliar por aberturas naturais.
Liberar o vácuo restaura a pressão atmosférica, forçando bactérias a entrarem nas folhas.
Repita os pulsos para alcançar a máxima infiltração.
Tire o pote. Depois, enxugue o excesso de inóculo.
As folhas infectadas por bactérias de Arabidopsis estão prontas para análise a jusante.
Estenda o estoque de glicerol da cepa de interesse de Pseudomonas syringae de menos 80 graus Celsius em uma placa LB suplementada com os antibióticos apropriados. Incube a placa a 28 graus Celsius por 40 a 48 horas. Raspe a biomassa bacteriana e resuspenda-a em cinco mililitros de cloreto de magnésio de 10 milimolares.
Meça a densidade óptica em 600 nanômetros e ajuste para 0,1 adicionando 10 milimolares de cloreto de magnésio. Realize diluições seriadas em cloreto de magnésio de 10 milimolares para obter uma concentração final de inoculo de 5 vezes 10 elevado ao quinto CFU por mililitro. Depois, prepare 200 mililitros de inóculo para as plantas de Arabidopsis e 50 mililitros para as plantas de feijão.
Antes da inoculação, adicione o surfactante Silwet L-77 a uma concentração final de 0,02% para inoculação de feijão e 0,01% para Arabidopsis. Para infiltração por Arabidopsis , coloque dois gravetos formando um X sobre o vaso e coloque o vaso voltado para baixo sobre uma placa de Petri de 14 centímetros de diâmetro contendo 200 mililitros de inoculo. Para inoculação com folhas de feijão, insira as plantas e a solução do inóculo em uma câmara de vácuo e introduza a folha em um tubo centrífugo cônico de 50 mililitros contendo o inoculo.
Dê um pulso de 500 milibares por 30 segundos para infiltrar as folhas. Drene o excesso de solução de inoculo com uma folha de papel e retorne as plantas à câmara de crescimento correspondente.