Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 2:00 min. • March 31st, 2026
Comece com células cianobacterianas fixas, imobilizadas e permeabilizadas aderidas a um cobertor.
Essas células cianobacterianas expressam proteínas reguladoras do crescimento de baixa abundância.
Durante a imagem de fluorescência de alta resolução, pigmentos sensíveis à luz naturais dentro das células cianobacterianas emitem fluorescência de fundo.
Isso reduz a qualidade da imagem ao visualizar essas proteínas de baixa abundância.
Para minimizar essa fluorescência de fundo, coloque a cobertura contendo as células cianobacterianas em um recipiente de coloração.
Adicione um tampão bloqueante contendo proteínas séricas para evitar a ligação inespecífica de anticorpos durante o processamento a jusante e um detergente para manter a permeabilidade celular.
Coloque a placa de tingimento sobre gelo e exponha as células à luz intensa de xenônio.
A luz de alta intensidade inicia o descolorimento fotográfico, quebrando pigmentos sensíveis à luz, enquanto proteínas reguladoras do crescimento de baixa abundância permanecem inalteradas.
Condições frias minimizam os danos causados pelo calor e preservam a integridade celular.
Esse processo permite a visualização clara de proteínas reguladoras de baixa abundância por meio de imunocoloração durante microscopia de fluorescência de alta resolução.
Transfira a capa lavada para a placa de tingimento.
Adicione 50 microlitros de buffer bloqueador no topo do cobertor. Coloque toda a taça de tingimento no gelo e depois mova-a sob a fonte de luz de xenônio para fotobranqueamento por pelo menos 60 minutos. Após fotobranquear e bloquear, use a borda de um papel toalha para remover o buffer bloqueador.