Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 3:46 min. • March 31st, 2026
Comece com amostras bacterianas pré-tratadas com concentrações crescentes de um antibiótico que elimina bactérias suscetíveis.
Adicione um meio de crescimento contendo óxido de deutério e a mesma concentração de antibiótico nos tubos correspondentes.
Incube os tubos sob condições de tremor.
O óxido de deutério entra nas células bacterianas, onde o deutério é incorporado às biomoléculas recém-sintetizadas, formando ligações carbono–deutério.
Centrifuge as bactérias, descarte o sobrenadante e lave.
Adicione um fixador para preservar a estrutura bacteriana.
Adicione água, centrifuge e remova o sobrenadante.
Ressuspenda as bactérias e transfira a suspensão para um vidro coberto revestido com poli-L-lisina, depois sele-o.
Coloque a amostra no palco de um microscópio de espalhamento Raman estimulado pré-calibrado ou SRS. Adicione água e diminua o objetivo.
Adquira imagens de múltiplos campos para avaliar a frequência vibracional carbono-deutério.
Em concentrações mais altas de antibióticos, o sinal de carbono-deutério diminui, indicando uma viabilidade bacteriana reduzida.
Isso possibilita uma avaliação rápida da suscetibilidade aos antibióticos ao correlacionar a intensidade do sinal SRS com a viabilidade bacteriana.
Após 1 hora de incubação, adicione 700 microlitros de antibiótico diluído em série com meio MHB contendo 100% de deutério aos 300 microlitros de bactérias pré-tratadas com antibiótico na mesma concentração. Homogeneize a mistura pipeteando várias vezes. Adicione 700 microlitros de meio 100% deutério contendo MHB sem antibióticos a 300 microlitros de bactérias sem antibióticos como controle positivo.
Adicione 700 microlitros de deutério contendo 0% sem antibióticos a 300 microlitros de bactérias sem antibióticos como controle negativo. Incube todos os microtubos a 37 graus Celsius e 200 rotações por minuto durante 30 minutos. Após a incubação, centrifuge 1 mililitro de amostra bacteriana tratada com antibiótico e deutério a 6.200 vezes g por 5 minutos a 4 graus Celsius. Depois, lave o pellet duas vezes com água purificada. Fixe as amostras em uma solução de formalina de 10% de volume por volume e armazene-as a 4 graus Celsius.
Para a preparação da amostra, lave 1 mililitro de solução bacteriana fixa com água purificada e centrifuge a solução bacteriana lavada a 6.200 vezes g por 5 minutos a 4 graus Celsius.
Remova o sobrenadante e enriqueça a solução bacteriana em cerca de 20 microlitros com água esterilizada. Deposite a solução bacteriana em um copo coberto revestido a poli-L-lisina, faça um sanduíche com outro copo de cobertura e fele a amostra. Coloque a amostra bacteriana na fase de amostra, sob o objetivo de imersão em água de 60x. Inicie a imagem SRS de amostras bacterianas. Imagine pelo menos três campos de visão para cada amostra.