Análise de Expressão Gênica de Células Únicas a partir de Patógenos Extraídos de Plantas

Pegue uma suspensão de uma bactéria patogênica isolada de uma planta infectada.

O genoma bacteriano contém uma fusão transcricional, na qual o promotor de um gene regulador da virulência também impulsiona a expressão de um gene fluorescente a jusante e sem promotor.

Durante a infecção da planta, a ativação do promotor desencadeia a produção das proteínas regulatórias e fluorescentes.

A proteína reguladora ativa genes de virulência, enquanto a fluorescência fornece uma leitura mensurável da ativação da virulência.

Centrifuge as células, descarte o sobrenadante e depois ressuspenda para obter uma suspensão concentrada.

Coloque uma gota em uma cobertura e cubra uma almofada de agarose para espalhar e imobilizar as células.

Capture uma imagem de campo claro para identificar todas as células bacterianas, depois uma imagem de fluorescência para detectar a fluorescência de célula única.

Combine ambos para visualizar diferenças de intensidade de fluorescência, que revelam subpopulações com alta, baixa ou nenhuma expressão gênica de virulência.

Essa variação fenotípica reflete uma estratégia adaptativa que aumenta a sobrevivência bacteriana durante a colonização das plantas.

Para uma análise de célula única, prepare uma solução de agarose a 1,5% em água destilada. Depois de derretido, adicione volume suficiente para preencher o espaço entre duas lâminas de microscopia colocadas lado a lado e coloque outra lâmina por cima. Deixe-os dirigir por 15 minutos e remova cuidadosamente o ferrolho colocado no topo.

Usando uma lâmina, corte a almofada de agarose em pedaços de 5 milímetros por 5 milímetros antes do uso. Paralelamente, centrifuge 1 mililitro das bactérias extraídas do apoplasto. Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta e ressuspenda o pellet em 20 microlitros de água para concentrar as células.

Coloque uma gota de 2 microlitros das células concentradas sobre uma capa de 0,17 milímetro e cubra a gota com um pedaço de almofada de agarose. Visualize a preparação bacteriana sob o microscópio confocal para identificar bactérias fluorescentes verdes usando lasers específicos. Identifique todas as bactérias usando o campo claro e funda ambos os campos.