JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 2:44 min • March 31st, 2026
Comece com um inserto Transwell contendo uma cocultura de células epiteliais e semelhantes a um cálice.
As células epiteliais formam junções apertadas, enquanto células semelhantes a cálices produzem muco, replicando a barreira epitelial intestinal in vivo.
Faça uma suspensão da comunidade bacteriana oral que foi tratada com fluido intestinal simulado para simular a digestão do intestino delgado.
Substitua o meio na câmara superior pela suspensão bacteriana.
Incube com sacudição para facilitar a adesão bacteriana e internalização.
Colete o meio da câmara superior contendo bactérias não aderentes para ensaios de viabilidade subsequentes.
Adicione uma solução dissolvente do muco e incube para solubilizar o muco e liberar as bactérias aderidas.
Colete a solução para análise adicional da viabilidade e adesão bacteriana.
Lave as células com tampão e adicione um detergente para deslocá-las.
Recolha a suspensão da cela.
Faça vórtice na suspensão para lisar as células e liberar as bactérias internalizadas.
Centrifugar e coletar separadamente os detritos sobrenadantes e celulares para análise posterior.
Após lavar e ajustar a densidade celular da digestão do intestino delgado conforme o protocolo de texto, retire o meio apical do sistema transwell e adicione 1,5 mililitros da suspensão bacteriana.
Co-cultive o sistema sob condições gerais de cultura celular por 2 horas. Adicione 0,5 mililitros de 10 milimolares de n-acetilcisteína em HBSS para solubilizar o muco produzido pelo HT29-MTX e recuperar as bactérias aderidas.
Incube as placas a 37 graus Celsius por 1 hora sob agitação. Recupere o NAC-HBSS em um tubo de microcentrífuga e use 1 mililitro de DPBS para lavar as células duas vezes. Adicione 0,5 mililitros de 0,5% de triton X-100 sobre as monocamadas e desregule as células pipetando.
Depois, recupere rapidamente o líquido no vórtice por 1 minuto. A rapidez é fundamental para evitar danificar as células bacterianas com o detergente. Analise as amostras de acordo com o protocolo de texto.