Extração de DNA Total de Folhas para Detecção de Infecção Bacteriana

Comece com pequenos pedaços de tecido foliar resfriado nos quais o floema está infectado por um patógeno bacteriano.

Coloque as peças em um almofariz com nitrogênio líquido para inibir a atividade das nucleases degradadoras do DNA.

Moa para desestabilizar mecanicamente as células e liberar componentes intracelulares.

Use uma espátula gelada para transferir o pó, adicione o tampão de lise e faça vórtice na suspensão.

Incubar para lisar núcleos de plantas e células bacterianas, liberando DNA e RNA enquanto desnaturaliza proteínas.

Adicione RNase e incube para degradar RNA.

Adicione um tampão de precipitação de proteínas às proteínas agregadas, depois centrifuge para separá-las.

Transfira o DNA vegetal e bacteriano que contém o sobrenadante para isopropanol, precipitando o DNA em fios semelhantes a fios.

Centrífuga para coletar DNA e descartar o sobrenadante.

Lave com etanol, depois centrifuge e descarte o sobrenadante.

Seque o DNA ao ar, depois adicione um tampão de reidratação e incube para dissolver.

As amostras de DNA agora estão prontas para detecção de patógenos baseadas em PCR a jusante posteriores.

Use tesouras limpas para cortar uma folha inteira e fresca de uma árvore cítrica e coloque em um saco plástico limpo para sanduíche. Depois, resfrie um pilão adicionando uma pequena quantidade de nitrogênio líquido. Em seguida, use a tesoura para cortar pequenos pedaços do tecido foliar, com aproximadamente uma polegada quadrada de tamanho.

Coloque os pedaços de folha no almofariz para congelá-los imediatamente. Comece rapidamente a moer o tecido foliar com o almofariz até que o nitrogênio líquido evapore e fique um pó verde fino. Em seguida, resfrie uma espátula de metal em nitrogênio líquido por 10 a 15 segundos. Depois, use a espátula fria para retirar o tecido moído do argamassa em um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros. Use uma pipeta de 1000 microlitros para adicionar 600 microlitros de solução de lise de núcleos à amostra. Depois, faça um vórtice na amostra por um a três segundos. Incube o tubo a 65 graus Celsius, em banho-maria por 15 minutos.

Após o término do período de incubação, use uma pipeta de 10 microlitros para adicionar 3 microlitros de solução de RNase ao lisado e remover o RNA. Depois, misture o conteúdo do tubo invertendo-o de duas a cinco vezes. Incube a 37 graus Celsius por 15 minutos em uma incubadora de armário. Após 15 minutos, adicione 200 microlitros de solução de precipitação proteica à amostra. Faça vórtice no tubo em alta velocidade por 20 segundos.

Em seguida, centrifuge a amostra a 13000 g por 3 minutos. Durante a centrifugação, adicione 600 microlitros de isopropanol mantido em temperatura ambiente a um novo tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante do tubo da centrífuga para o tubo contendo isopropanol. Descarte a cápsula.

Inverta o tubo para que o DNA fique visível como uma fita fiante. Em seguida, centrifuge a amostra a 13000 g por um minuto em temperatura ambiente.

Decante o sobrenadante após a centrifugação. Depois, adicione 600 microlitros de etanol a 70% ao pellet. Inverta o tubo várias vezes para lavar o pellet. Centrifuge o tubo a 13.000 g por 1 minuto. Após a centrifugação, aspire cuidadosamente o sobrenadante. Depois, inverta o tubo com a tampa aberta em um papel absorvente para secar ao ar por 15 minutos. Depois de seco, adicione 100 microlitros de solução de reidratação de DNA ao pellet. Incube a suspensão de DNA a 65 graus Celsius em banho-maria por uma hora.