An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 3:50 min • July 1st, 2026
Take an anesthetized mouse fasted overnight to reduce bowel movements.
Apply eye ointment to prevent corneal drying. Secure it on a heating pad to regulate body temperature.
Expose the right jugular vein. Insert a catheter and secure it with stitches.
Open the peritoneal cavity, then place the mouse on a transparent plate.
Spread the intestine to expose the mesenterium, a supportive membrane, to access the blood vessels.
Maintain body temperature and apply saline to prevent dehydration.
Place the mouse under a fluorescence microscope, then immobilize the vessels.
Apply an ionophore that elevates calcium levels in endothelial cells. This triggers the release of von Willebrand factor (VWF), forming coiled strands on the cell surface.
Inject fluorescently labeled bacteria through the catheter to reach the blood vessel.
The shear stress from blood flow uncoils the VWF strands, which bind to bacterial adhesins and form bacterial aggregates.
Capture time-lapse images to quantify shear-dependent bacterial adhesion.
Fast six to eight-week-old mice the night before the experiment to reduce bowel movement. The day of the experiment begin by injecting 0.1 milligrams of buprenorphine per kilogram of body weight as an analgesic. Next, anesthetize the mouse and apply ointment to the eyes.
Place the mouse on the thermo-controlled heating pad under the dissecting scope and test that the mouse shows no pedal reflex. Make a one-centimetre incision parallel to the jugular vein. Remove the right side of the cervical muscle and then isolate the jugular vein from the surrounding tissue.
Insert a two French intravenous catheter into the right jugular vein and secure it in place using stitches. Then, make a midline abdominal incision to open the peritoneal cavity. Place the mouse on its right side on a transparent plate and secure the cannula with tape.
Gently pull out the intestines using cotton swabs and spread the mesenterium to visualize the mesenteric arteriolar and venular circulation. Place a hot pack over the mouse to prevent hypothermia and drop 500 microliters of 0.9% NaCl on the intestines every 30 minutes to prevent dehydration of the tissue. Use cotton swabs to immobilize the vessels and visualize them under an inverted microscope.
Next, topically, apply five microliters of a 10 millimolar solution of calcium ionophore dissolved in DMSO. This will activate the release of von Willebrand factor from the endothelial cells in the vessels. After 10 seconds, inject 100 microliters of the fluorescently labeled bacteria through the jugular catheter. At this time, begin taking time-lapse images. Acquire time-lapse images using the acquisition tool in the toolbar, using 40 cycles of 1000 images per second. Once image acquisition is complete, euthanize the mouse according to institutional guidelines. Save the images in an appropriate image file format, and then process the images using ImageJ analysis software as previously described.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado in vivo para estudar a adesão bacteriana dependente de cisalhamento à parede do vaso em um modelo vivo de camundongo. O método combina preparação cirúrgica, cateterização e imagem de fluorescência em tempo real para visualizar e quantificar as interações entre o fator de von Willebrand (VWF) e bactérias sob condições fisiológicas de fluxo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Biologia vascular
- Imagem in vivo
Antecedentes
- A adesão bacteriana às paredes dos vasos sanguíneos é uma etapa crítica na patogênese das infecções na corrente sanguínea.
- O estresse cisalhante do fluxo sanguíneo influencia a interação entre bactérias e superfícies endoteliais.
- O fator de von Willebrand (VWF) é liberado pelas células endoteliais e desempenha um papel na mediação da agregação bacteriana sob fluxo.
- A imagem em tempo real em animais vivos fornece informações sobre esses processos dinâmicos.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um modelo in vivo para analisar a adesão bacteriana às paredes dos vasos sob condições de fluxo.
- Visualizar em tempo real a formação de filamentos de VWF e sua interação com bactérias.
- Quantificar a agregação bacteriana dependente da tensão de cisalhamento em superfícies endoteliais.
Métodos Utilizados
- Jejum noturno e anestesia de camundongos para preparação cirúrgica.
- Exposição cirúrgica e cateterização da veia jugular direita.
- Exposição da vasculatura mesentérica por meio de incisão abdominal e posicionamento sobre uma placa transparente.
- Aplicação tópica de um ionóforo de cálcio para induzir a liberação de VWF a partir de células endoteliais.
- Injeção de bactérias marcadas com fluorescência através do cateter.
- Microscopia de fluorescência em tempo real e aquisição de imagens com lapso de tempo.
- Análise de imagens utilizando o software ImageJ.
Resultados Principais
- A aplicação de ionóforo de cálcio induz a formação de filamentos de VWF nas superfícies endoteliais.
- O estresse por cisalhamento do fluxo sanguíneo desenrola os filamentos de VWF, facilitando a ligação e agregação bacteriana.
- A imagem por fluorescência permite a visualização e quantificação de eventos de adesão bacteriana.
- O protocolo permite o estudo controlado de interações bacterianas-endoteliais dependentes de cisalhamento in vivo.
Conclusões
- Este modelo in vivo demonstra efetivamente o papel do estresse cisalhante e do FVW na adesão bacteriana às paredes dos vasos.
- A abordagem fornece uma plataforma para o estudo das interações entre hospedeiro e patógeno sob condições fisiológicas de fluxo.
- Pode ser adaptado para investigar os mecanismos de infecção vascular e avaliar possíveis intervenções terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A adesão bacteriana dependente de cisalhamento é um fator crítico na patogênese das infecções vasculares e influencia a validação inicial de alvos para terapêuticas anti-adesão. Este modelo in vivo permite a quantificação em tempo real das interações entre bactérias e endotélio sob fluxo fisiológico, reforçando a confiança preditiva na desvinculação mecanicista. A abordagem orienta decisões de portfólio ao esclarecer a dinâmica hospedeiro-patógeno relevante para pesquisas pré-clínicas de doenças infecciosas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta dos mecanismos de adesão bacteriana sob tensão cisalhante fisiológica.
- Apóia a validação funcional de alvos como o fator de von Willebrand nas interações entre hospedeiro e patógeno.
- Oferece desvio mecanicista para estratégias terapêuticas anti-adesão.
- Facilita a confiança preditiva em modelos precoces de doenças infecciosas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Estabelece um sistema in vivo validado para quantificar eventos de adesão bacteriana.
- Fornece saídas de imagem reprodutíveis e quantitativas para análise posterior.
- Apoia a padronização de ensaios para avaliação de intervenções candidatas que visam vias de adesão.
- Permite comparação confiável de cepas bacterianas ou efeitos terapêuticos sob condições controladas de fluxo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a modelos de infecção vascular relevantes para doenças na exploração translacional de biomarcadores.
- Oferece continuidade desde estudos mecanicistas em fase de descoberta até a validação pré-clínica de agentes antiadesão.
- Informa decisões de avanço ajustadas ao risco para portfólios de doenças infecciosas.
- Apoia a redução de riscos mecanicistas no contexto da patogênese da infecção vascular.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este modelo de imagem in vivo conecta a descoberta inicial e a pesquisa pré-clínica ao permitir a investigação orientada por hipóteses da adesão bacteriana sob fluxo.
- Biologia Descoberta: Esclarece o papel do estresse cisalhante e do FVW na adesão bacteriana, apoiando testes de hipóteses e desvio biológico de riscos.
- Triagem: Fornece saídas de imagem quantitativas e reproduzíveis para o desenvolvimento de ensaios e avaliação de candidatos.
- Análises: Gera dados de imagens em lapso de tempo para comparação estatística robusta de eventos de adesão entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas mecanicistas a modelos de infecção vascular com relevância para doenças.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável adaptável a diversas cepas bacterianas e estudos de intervenção.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e a validação de alvos para estratégias antiaderentes.
- Valor Operacional: Fornece fluxos de trabalho de imagem in vivo padronizados, reprodutíveis e escalonáveis.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção e reduz os riscos biológicos em estágios avançados em programas de doenças infecciosas.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização e o avanço ajustados ao risco de terapêuticas antiaderentes.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cirurgia de pequenos animais e em técnicas de imagem in vivo.
- Exige acesso à infraestrutura de microscopia de fluorescência e análise quantitativa de imagens.
- Necessita padronização entre equipes para aquisição e análise de dados reprodutíveis.
- Adaptável a diferentes cepas bacterianas e modalidades de intervenção mediante otimização do protocolo.
- Limitado a leitos vasculares acessíveis à imagem e pode exigir ajustes específicos ao modelo.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
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Última atualização: 29 agosto 2026