Name: Dissecção da Human Elements Corpo Vítreo para Análise Proteômica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-23T17:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Aprenda técnicas de dissecação do corpo vítreo humano para análise proteômica. Este método demonstra a remoção precisa do segmento anterior e isolamento das subestruturas vítreas em olhos post mortem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O financiamento foi fornecido pelo Fight for Sight. Tecidos foram obtidos do Banco de Olhos Lions Iowa.

1. A dissecção do segmento anterior. <ol><li> A córnea é removida por primeiro fazer uma incisão no limbo dentro da câmara anterior utilizando uma lâmina de 15 ° (Figura 1). Em seguida, uma lâmina curvada de córnea escleral-tesoura é inserida dentro da câmara anterior. Circunferencial cortes são feitos na córnea, apenas anterior ao limbo. </li><li> 0,12 Colibri pinças e tesoura Westcott são usados ​​para cortar a íris circunferencialmente anterior ao corpo ciliar. </li><li> O núcleo da lente foi removida com fórceps 0,12 Colibri ou uma lâmina de 15 ° (supersharp) e do córtex e da cápsula com uma pinça. </li></ol> 2. Aspiração Central vítreo. <ol><li> Uma agulha 23 gauge em uma seringa de 5 cc é inserido em meados da década de vítreo (Figura 1). </li><li> Aproximadamente 1 mL ou mais do núcleo vítreo é suavemente aspirado. </li><li> A amostra é então colocada em um tubo de microcentrífuga e depois em nitrogênio líquido. </li></ol> 3. Dissecação hialóide anterior. <ol><li> A hialóide anterior é visto como um anel semi-transparente, ajustando a luz incidente de um microscópio de luz ganso pescoço. Aspiração anteriores do núcleo vítreo se separa da hialóide anterior de outras estruturas para facilitar a identificação. </li><li> A folha de tecido elástico é cuidadosamente puxado para longe do corpo ciliar com Colibri ou fórceps vestir-se e cortou com uma tesoura Vannas. Esta manobra é repetida. </li><li> A amostra é então colocada em um tubo de microcentrífuga e depois em nitrogênio líquido. </li></ol> 4. Dissecção da Base vítreo. <ol><li> Usando 0,12 fórceps para estabilizar a taça do olho, uma tesoura Westcott são usados ​​para "flor" o olho fazendo quatro igualmente espaçados de aliviar o stress cortes do corpo ciliar em direção à cabeça do nervo óptico. </li><li> A pars plicata do corpo ciliar (Figura 2) é removida de cada um dos quadrantes usando uma tesoura Westcott. </li><li> A base vítrea é, então, agarrou em ambos os lados da ora serrata com uma pinça sobre o pars plana e retina (Figura 2). </li><li> Tração contínua sobre a base vítrea é aplicada com a pinça. Corte sequencial com tesoura Westcott extrai um tecido semi-transparente com um "colar de pérolas" aparência como é extirpado. </li><li> A amostra é então colocada em um tubo de microcentrífuga e depois em nitrogênio líquido. </li></ol> 5. Remoção Cortex vítreo. <ol><li> A pars plana é retirado de cada um dos quadrantes com tesoura Westcott cortando o folheto aproximadamente 3 mm posterior à ora serrata (Figura 2). </li><li> Entre os folhetos de tecido, o córtex do vítreo é visualizado como um filme semi transparente. </li><li> O filme elástico ou é apreendido com 0,12 forceps ou detidos pela adesão a uma esponja Weck-Cel cirúrgico. O córtex vítreo é, então, afastou-se da retina e retirado com tesoura Westcott (Figura 1). </li><li> A amostra é colocada em um tubo de microcentrífuga e depois em nitrogênio líquido. Todas as amostras são armazenadas a -80 ° C até utilizados para a experimentação. </li></ol> 6. Resultados representante Amostras de tecido pode ser processado por uma variedade de métodos para experimentos específicos. No nosso caso, as amostras foram submetidas a análise de proteínas por SDS-PAGE (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Transversal visão do olho humano representando subestruturas diferentes do corpo vítreo. O vítreo mais anterior é uma fina camada de colágeno chamado de hialóide anterior. O núcleo vítreo compreende toda a região central do corpo vítreo. Esta parte do vítreo é mais aquosa em contraste com a base vítrea, que é viscoso o suficiente para ser captado por uma pinça e está firmemente ligado ao corpo ciliar e retina subjacente. Abrangendo o núcleo vítreo é um shell muito finas de colágeno chamada córtex vítreo. <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Anatomia base vítrea. A base do vítreo é uma infra-estrutura semi-transparente do corpo vítreo localizado junto à ora serrata (setas brancas), que é a linha divisória que separa o corpo ciliar e retina. A borda anterior da base do vítreo se estende sobre a pars plana (linha branca) do corpo ciliar. A borda posterior da base vítrea estende 2-3 mm posterior à ora serrata (traço branco). Para extirpar a base do vítreo, uma pinça são usados ​​para captar o tecido e puxe-o para longe do corpo ciliar e retina subjacente. Uma vez elevado, tesoura Westcott são usados ​​para cortar ao longo da base. <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Unidimensional SDS-PAGE de elementos do corpo vítreo. Concentrações de proteína total para a hialóide anterior, base vítrea, vitreous núcleo e córtex vítreo foram 11,24, 20,1, 16,61, 14,24 mg / mL, respectivamente. Eletroforese em gel foi realizada em 200 kV por 45 minutos, corados com Flamingo (Bio-Rad), e visualizados através de um VersaDoc Imaging System (Bio-Rad). Os perfis para os diferentes tecidos mostrar várias bandas similares, indicando quer conservada ou cross-contaminação proteínas, bem como as bandas originais (asterisco), indicando proteínas diferencialmente localizada.

<ol><li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Prog Retin Eye Res. 19, 323-344 (2000).</li>
<li>Sebag, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pharmacologic+vitreolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Am+Ophthalmol+Soc%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pharmacologic vitreolysis.</a> Trans Am Ophthalmol Soc. 103, 473-494 (2005).</li>
<li>Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+inflammatory+immune+mediators+in+vitreoretinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases.</a> PLoS One. 4, e8158-e8158 (2009).</li>
<li>Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P., Feener, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+vitreous+proteome+in+diabetes+without+diabetic+retinopathy+and+diabetes+with+proliferative+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy.</a> J Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).</li>
<li>Izuta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+SOD+and+VEGF+are+increased+in+vitreous+bodies+from+proliferative+diabetic+retinopathy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients.</a> Mol Vis. 15, 2663-2672 (2009).</li>
<li>Azimzadeh, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+proteome+analysis+using+gel-free+and+gel-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics.</a> J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O corpo vítreo é um gel semi-transparente, cuja composição molecular é mal compreendida, especialmente no nível de suas subestruturas: a base do vítreo, núcleo, córtex, e hialóide anterior. O núcleo vítreo contém colágenos II, V, IX e XI, juntamente com proteoglicanos sulfato de condroitina, sulfato de heparan proteoglicanos, e. Hyaluronan 1,2 biomarcadores de proteína no núcleo vítreo têm sido associadas a doenças como a retinopatia diabética. 3-5 Como estas proteínas são diferencialmente expressos em cada uma das subestruturas, e em muitos casos, as identidades de proteínas específicas, não são conhecidos. Estas informações podem dar uma visão sobre a origem de proteínas associadas com certas doenças vítreo-retinianas e ajudar a futuras terapias-alvo. Embora o ideal intervalo post mortem para dissecção dos tecidos não foi determinado, a degradação de proteínas pode afetar experimentos a jusante. Por exemplo, imuno-histoquímica é afetado nos olhos de 12 horas pós-morte e algumas atividades de enzima específica pode ser reduzida dentro de algumas horas (observação não publicada). Todos os tecidos no presente estudo foram coletados entre 2 e 8 horas de morte, sem mudanças significativas na expressão da proteína ou da aptidão para analsyis proteômica. O método de congelamento de nitrogênio líquido de preservação é escolhido em detrimento de fixação para evitar pequenas mudanças na estrutura da proteína causada por fixador reticulação, que tem sido demonstrada em outros tecidos por LC-MS/MS. 6 estudos Proteômica dependerá da capacidade de precisão dissecar os diferentes compartimentos do vítreo, como demonstrado nesta experiência de vídeo. Temos validou a técnica de dissecção utilizando 1-dimensional SDS-PAGE. Como nossos resultados sugerem, existem proteínas diferencialmente expressos no corpo várias subestruturas vítreo. A identificação dessas proteínas irá fornecer uma compreensão mais detalhada de compartimentalização vítreo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 0,12 forceps </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1502 </td></tr><tr><td> 5 cc-seringa </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> Pinça reta vestir Com serrilhas </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1400 </td></tr><tr><td> Agulha de calibre 23 </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 305145 </td></tr><tr><td> Colibri forceps </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> 2 / 132 </td></tr><tr><td> Castroviejo em ângulo tesoura de córnea </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3223 </td></tr><tr><td> Vannas Curved Tesoura Capsulotomia </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3387 </td></tr><tr><td> Weck-Cel cirúrgica lanças </td><td> Medtronic </td><td> 0008680 </td></tr><tr><td> Westcott Curved Tesoura Tenotomia </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3320 </td></tr></tbody></table>

dissecção da human elements corpo vítreo para análise proteômica

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

O vítreo é uma opticamente clara, matriz extracelular de colágeno, que preenche o interior do olho e recobre a retina. 1,2 interações anormais entre subestruturas vítreo e da retina subjacentes várias doenças vítreo-retinianas, incluindo rasgaduras da retina e descolamento, pucker macular, buraco macular, idade degeneração macular relacionada à tração vítreo, Vitreorretinopatia proliferativa, retinopatia diabética proliferativa, e vitreoretinopathies herdada. 1,2 A composição molecular do vítreo subestruturas não é conhecido. Desde que o corpo vítreo é transparente com acesso cirúrgico limitado, tem sido difícil de estudar suas subestruturas no nível molecular. Desenvolvemos um método para separar e preservar estes tecidos para análise proteômica e bioquímica. A técnica de dissecção neste vídeo experimental mostra como isolar base vítrea, hialóide anterior, o núcleo vítreo, e no córtex vítreo dos olhos pós-morte humana. Unidimensional SDS-PAGE análises de cada componente do vítreo mostrou que a nossa técnica de dissecção resultou em quatro perfis de proteína única correspondente a cada subestrutura do corpo vítreo humano. Identificação de proteínas diferencialmente compartimentada irá revelar as moléculas candidato subjacente várias doenças vítreo-retinianas.

Este vídeo mostra uma técnica eficaz para diferenciar e dissecando os vários semi-transparente das estruturas do corpo humano na pós vítreos olhos mortem.

Dissecção da Human Elements Corpo Vítreo para Análise Proteômica

O vítreo é uma matriz extracelular colagenosa e opticamente transparente que preenche o interior do olho e recobre a retina. 1,2 Interações anormais ...

O vítreo é uma matriz extracelular opticamente clara que preenche o interior do olho. Pode ser dividido em várias subestruturas, incluindo a hialoide anterior atrás do cristalino, a base vítrea na retina anterior, o córtex vítreo formando uma camada elástica e o núcleo vítreo no centro. Para dissecar o vítreo, precisamos primeiro remover o segmento anterior.Uma lâmina extremamente afiada é usada para fazer uma incisão na córnea na região do limbo. Em seguida, utiliza-se uma tesoura de córnea-esclera para cortar a córnea logo anterior ao limbo. A íris é dissecada com tesoura curva, puxando-a de sua superfície.Uma pressão suave sobre o globo pode expulsar o núcleo. Para remover o corpo vítreo, utilize uma agulha de calibre 23 em uma seringa de cinco cc e aspire o vítreo, que é principalmente líquido. O hialoide anterior torna-se visível como uma estrutura fina e transparente em forma de membrana, que pode ser segurada com pinça.É uma estrutura elástica localizada logo atrás da lente. O círculo interno é o ligamento de Wieger. Tesouras de Van são usadas para cortar o hialóide enquanto a pinça aplica tração.O tecido lat pode ser transferido para um tubo afu e a manobra é repetida até que todo o tecido tenha sido dissecado. Para acessar as subestruturas vitreais remanescentes, é necessário abrir o olho utilizando tesoura curva de Westcott. Cada uma das abas é afastada com pinça em uma placa de Petri.Esta imagem mostra a anatomia da base do vítreo, um tecido fino e transparente que se estende ao longo da ora serrata. A ora serrata é a linha divisória entre o corpo ciliar anteriormente e a retina posteriormente. Diferentemente de outras partes do vítreo, a base do vítreo adere firmemente ao corpo ciliar e à retina subjacentes, de modo que puxar com pinça realmente eleva o tecido.Para isolar a base do vítreo, primeiro removemos a pars plana utilizando pinça e tesoura de Westcott. A pars plana é essa pequena região com sulcos. Em seguida, para isolar a base do vítreo, corte dois a três milímetros posteriores à ora serrata com a tesoura de Westcott, estabilizando o olho com a pinça, segure e aplique tração sobre a base do vítreo utilizando a pinça e corte sequencialmente com a tesoura de Westcott.Observa-se uma aparência semelhante a um colar de pérolas quando a base do vítreo é removida, podendo-se notar como essa matriz extracelular pode compartimentalizar proteínas. Diferentes técnicas podem ser utilizadas para dissecar a camada do vítreo. O contato com uma esponja de células WEX elevará o córtex.Uma borda do córtex pode ser encontrada entre os folhetos, conforme mostrado aqui. Novamente, use a pinça para criar tração e localize a tesoura de VanNess para cortar sequencialmente o córtex vítreo. O córtex também pode ser elevado a partir do disco e, neste caso, tesouras maiores de Westcott são utilizadas para dissecar o córtex enquanto ele é cuidadosamente destacado da superfície da retina.As amostras podem então ser colocadas em um microtubo e armazenadas para análise proteômica posterior.

dissection-of-human-vitreous-body-elements-for-proteomic-analysis

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O primata não-humano é uma importante espécie de translação para a nossa compreensão do desenvolvimento e envelhecimento. A organização anatômica da retina de primatas pode fornecer importantes insights sobre condições normais e patológicas nos seres humanos.

A entrada para o cérebro: Dissecando o olho Primaz

A técnica de dissecção ilustra a evisceração do vítreo, retina, ea lente do olho do rato, a separação por centrifugação, e caracterização de proteínas com os ensaios.

Evisceração de Vítreo Mouse e Retina de Análises Proteômica

Retina neural de um rato com idade entre 8 dias é em cima de um bloco de gelatina 4%. Após o isolamento da camada de fotorreceptores (200 mm) por vibratome, as células fotorreceptoras são cultivadas após dissociação enzimática e mecânica para a cultura. A camada de fotorreceptores pode ser utilizado para análises moleculares, bioquímicas ou transplante.

Vibratome Seccionamento Rato Retina de Preparar culturas Fotorreceptoras

O objetivo deste protocolo é mostrar uma técnica eficaz para isolar o núcleo vítreo e o córtex vítreos inteiros e intactos de olhos suínos enucleados post mortem.

Whole humor vítreo Dissecção de Análise Vitreodynamic

A retina humana é composta de regiões funcionalmente e molecularmente distintas, incluindo a fóvea, mácula e retina periférica. Aqui, descrevemos um método usando o soco de biópsias e remoção manual das camadas de tecido do olho humano para dissecar e coletar estas regiões distintas da retina para análise proteômica a jusante.

Dissecação da Retina humana e RPE coroide para análise proteômica

Caracterização do Proteome de leitos microvasculares oculares é crucial para a compreensão aprofundada de muitas patologias oculares em seres humanos. Este estudo demonstra um método eficaz, rápido e robusto para a extração de proteínas e preparação da amostra de pequenos vasos sanguíneos, empregando porcinos curtas posteriores artérias ciliares como vasos de modelo para análise proteômica de espectrometria de massa-base.

Preparação da amostra para análise de Proteomics baseados em massa-espectrometria de Microvessels Ocular

Descrevemos um método para separar eficientemente o epitélio pigmentar da retina (EPR) da retina em olhos humanos e gerar montagens planas inteiras de EPR/coroide para análises histológicas e morfométricas da EPR.

Geração eficiente e consistente de epitélio/coroide de pigmento da retina a partir de olhos humanos para análise histológica

Este protocolo apresenta uma plataforma integrada de biorrepositório para coleta, anotação e biobanco padronizados de biópsias de humor aquoso humano e vítreo líquido de alta qualidade para análises moleculares a jusante, incluindo proteômica, metabolômica e glicômica.

Biobanco de biópsias humanas aquosas e vítreas líquidas para análises moleculares

A retina exibe uma organização espacial complexa em toda a sua estrutura laminar. As técnicas modernas de transcriptômica espacial e sequenciamento requerem seções de tecido &lt; 20 μm de espessura, limitando sua aplicabilidade na pesquisa da retina. Este método de crioseccionamento recém-congelado produz seções finas na face da retina do camundongo, preservando as relações espaciais planares, permitindo um mapeamento molecular abrangente entre as lâminas.

En face Crioseccionamento de retina de camundongo para análise molecular espacial de alta dimensão

Este método visualiza a estrutura nativa das fibras colágenas no corpo vítreo usando microscopia de reflectância confocal.

Preparação de olhos suínos para microscopia de refletância confocal para visualizar a rede de fibras de colágeno vítreo

Aprenda técnicas de dissecação do corpo vítreo humano para análise proteômica. Este método demonstra a remoção precisa do segmento anterior e isolamento das subestruturas vítreas em olhos post mortem.

Dissecção da Human Elements Corpo Vítreo para Análise Proteômica

Explorar mais vídeos