Plaque Assay–Based Quantification of Viral Load in an Infected Mouse Tissue Sample
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 3:40 min • July 1st, 2026
Take epithelial cell monolayers. Add diluted supernatants from a virus-infected mouse tissue homogenate.
Incubate for viral adsorption, then wash.
Cover the cells with agar-containing medium, forming a semisolid overlay, and incubate.
The virus enters cells, replicates, and lyses them, releasing new viruses.
The solidified agar restricts viral spread, forming clear zones called plaques.
Remove the overlay. Treat with a fixative to inactivate viruses.
Add a permeabilization buffer to disrupt cell membranes.
Add a blocking buffer to prevent non-specific interactions.
Add primary antibodies. Incubate to allow their interactions with viral nucleocapsid proteins.
Wash and add biotin-conjugated secondary antibodies that bind to the primary antibodies.
Rinse and introduce avidin-biotin-peroxidase complexes, which bind to biotin on the secondary antibodies.
Add chromogenic substrates that react with peroxidase to produce brown precipitates, which stain the plaques.
Count the plaques at different dilutions to quantify the viral load in the tissue sample.
Utilizing the supernatant obtained from the tissue homogenates, perform tenfold serial dilution and infect confluent monolayers of Vero E6 cells with one milliliter of each supernatant dilution in triplicates.
Let the virus adsorb for one hour at 37 degrees Celsius in a humidified 5% carbon dioxide incubator. Once done, wash the cells with one milliliter of 1X PBS and then incubate the cells in two milliliters of post-infection media containing 1% agar in the humidified 5% carbon dioxide incubator at 37 degrees Celsius for 72 hours. After the incubation, inactivate the plates in 10% neutral buffered formalin for 24 hours at four degrees Celsius, ensuring the entire plate is submerged.
Take plates out of biosafety level three and wash the cells three times with one milliliter of 0.5% Triton X-100 for 10 minutes at room temperature. Next, block the permeabilized cells with one milliliter of 2.5 bovine serum albumin or BSA and PBS for one hour at 37 degrees Celsius, followed by incubation in one milliliter of one microgram per milliliter of the SARS-CoV nucleocapsid protein cross-reactive monoclonal antibody 1C7C7 diluted in 2.5 BSA for one hour at 37 degrees Celsius. Wash the cells three times with one milliliter of 1X PBS and develop the plaques using the ABC and diaminobenzene, or DAB, peroxidase substrate kits according to the manufacturer's instructions, then calculate the viral titers as plaque forming units per milliliter.
Visão Geral
Este artigo detalha um protocolo para quantificar cargas virais infecciosas de SARS-CoV-2 em amostras de tecido de camundongos transgênicos K18 hACE2 utilizando um ensaio de placa. O método envolve a infecção de monocamadas de células epiteliais com sobrenadantes de homogenatos teciduais, seguida por imunomarcação e contagem de placas para determinar os títulos virais.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Virológia
- Pesquisa em doenças infecciosas
- Ensaios virais quantitativos
Contexto
- A quantificação precisa de vírus infecciosos em tecidos é essencial para avaliar a patogênese viral e intervenções terapêuticas.
- Os ensaios de placas são um padrão-ouro para medir partículas virais infecciosas.
- Camundongos transgênicos K18 hACE2 são um modelo amplamente utilizado para estudos de infecção por SARS-CoV-2.
- A imunomarcação melhora a visualização e a especificidade das placas.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para quantificar a infecção por SARS-CoV-2 em tecidos de camundongos.
- Permitir a medição reprodutível de títulos virais utilizando ensaios de placas e imunomarcação.
- Facilitar estudos sobre patogênese viral e eficácia de intervenções em modelos de camundongos transgênicos.
Métodos Utilizados
- Preparação de homogeneizados teciduais de camundongos infectados com vírus.
- Diluição seriada em dez vezes dos sobrenadantes e infecção de monocamadas de células Vero E6.
- Incubação com camada superior contendo ágar para restringir a disseminação viral e formar placas.
- Fixação, permeabilização e bloqueio das células.
- Imunomarcação com anticorpos primários e secundários conjugados com biotina direcionados à proteína do nucleocapsídeo viral.
- Visualização utilizando o complexo avidina-biotina-peroxidase e substrato cromogênico (DAB).
- Contagem de placas e cálculo dos títulos virais em unidades formadoras de placas por mililitro.
Resultados Principais
- Placas claras e contáveis são formadas em monocamadas de células infectadas.
- A imunomarcação com anticorpos específicos para nucleocapsídeo melhora a detecção de placas.
- Os títulos virais podem ser quantificados com precisão a partir de amostras de tecido.
- O protocolo é reprodutível e adequado para ambientes laboratoriais de alta contenção.
Conclusões
- O protocolo de ensaio de placa descrito permite a quantificação precisa de SARS-CoV-2 infeccioso em tecidos de camundongos.
- A imunomarcação aumenta a especificidade e a clareza da visualização das placas.
- Este método possibilita a avaliação robusta de infecções virais e estudos de intervenção em modelos de camundongos transgênicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação da carga viral em tecidos de camundongos infectados por meio do ensaio de placa fornece uma leitura quantitativa padrão-ouro para vírus infeccioso, apoiando a validação robusta de alvos e a redução de riscos mecanicistas no desenvolvimento de antivirais&D. Este método permite a medição precisa da replicação viral e da eficácia de intervenções, orientando decisões iniciais de descoberta e pré-clínicas. Sua reprodutibilidade e especificidade são fundamentais para a triagem de portfólios e a continuidade translacional em pipelines de doenças infecciosas.
Aplicações Estratégicas em P&D Biofarmacêutico
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação quantitativa de hipóteses antivirais em modelos de camundongos relevantes para a doença.
- Apóia a validação funcional de alvos virais mediante a medição da produção infecciosa.
- Oferece desvio mecanicista de riscos ao distinguir partículas virais infecciosas de não infecciosas.
- Facilita a confiança preditiva no engajamento de alvos e nos efeitos de intervenções.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece leituras quantitativas validadas de carga viral para fluxos de trabalho de triagem posteriores.
- Padroniza as condições do ensaio para garantir reprodutibilidade e comparabilidade entre estudos.
- Permite escalabilidade e reutilização da plataforma para avaliação de compostos em ambientes de alta contenção.
- Apoia o desenvolvimento robusto de ensaios com detecção de placas aprimorada por imunomarcação.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a modelos in vivo relevantes para a doença no desenvolvimento translacional de biomarcadores.
- Garante a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica da eficácia antiviral.
- Reduz o risco nas decisões de avanço ao fornecer leituras quantitativas de infecção.
- Apoia a compreensão mecanicista da patogênese viral em sistemas modelo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de ensaio de placa integra desde a descoberta inicial até a pesquisa pré-clínica, permitindo testes de hipóteses, triagem e validação translacional em pipelines de doenças infecciosas.
- Biologia de Descoberta: Quantifica a produção viral infecciosa para apoiar testes de hipóteses e redução de riscos biológicos.
- Triagem: Fornece resultados reprodutíveis e quantitativos de ensaios para avaliação de compostos.
- Análises: Permite comparação estatística de cargas virais entre diferentes condições experimentais e intervenções.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro e in vivo para alinhamento de biomarcadores e eficácia.
- Reutilização Corporativa: Oferece uma plataforma padronizada e reutilizável para quantificação de vírus infecciosos em diversos programas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva e validação de alvos por meio de leituras quantitativas de infecção.
- Valor Operacional: Garante padronização, reprodutibilidade e escalabilidade do ensaio em laboratórios de alta contenção.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir/interromper e reduz riscos biológicos em fases avançadas em portfólios de antivirais.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização e o avanço de candidatos antivirais com ajuste de risco.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência e conhecimento especializado em virologia, bem como experiência com procedimentos de alta contenção (NBL-3).
- Necessita de acesso a instrumentação especializada para cultivo celular, imunomarcação e visualização de placas.
- Exige padronização rigorosa entre equipes para garantir reprodutibilidade e comparabilidade dos dados.
- Pode exigir adaptação para diferentes cepas virais ou tipos de tecidos, conforme suportado pelo protocolo.
- As limitações práticas incluem os requisitos de biossegurança e as restrições de produtividade inerentes à contagem manual de placas.
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Última atualização: 29 agosto 2026