Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 2:22 min. • August 31st, 2026
Inicie com um frasco de cultura contendo células de rim embrionário humano em um meio rico em nutrientes.
Substitua o meio por meio fresco contendo cloroquina para aumentar a entrega do plasmídeo nas células.
Utilize uma mistura de plasmídeos que codificam proteínas da superfície da influenza, proteínas do core lentiviral e o genoma lentiviral, juntamente com fosfato de cálcio. Incube para formar complexos de DNA com fosfato de cálcio.
Adicione a mistura às células e misture suavemente. Incube para permitir que o complexo entre nas células por endocitose. A cloroquina promove a liberação plasmidial dos endossomos.
No interior da célula, o DNA plasmidial induz a expressão de componentes tanto da influenza quanto do lentivírus.
Substitua o meio para remover os complexos em excesso.
Incube para permitir que os componentes virais sejam montados e liberados como pseudovírus, que são liberados no meio de cultura.
Colete o meio contendo os pseudovírus e centrifugue para formar um pellet de detritos celulares.
Colete o sobrenadante contendo o pseudovírus e armazene-o em temperaturas baixas para ensaios posteriores.
Para começar, prepare uma suspensão simples de células HEK 293FT em meio DMEM completo. Adicione dez mililitros da suspensão simples de células a um frasco T75, seguido por incubação a trinta e sete graus Celsius.
Duas horas antes da transfeção, substitua o meio antigo por dez mililitros de meio completo fresco com cloroquina. Misture os reagentes e o DNA plasmidial conforme descrito no manuscrito. Em seguida, transfira essa mistura para o meio acima das células e agite suavemente.
Após a incubação, substitua o meio por quinze mililitros de meio DMEM completo fresco. Após sessenta e cinco horas, colete o sobrenadante por centrifugação. Recolha o sobrenadante e alíquota-o.