Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 2:54 min. • August 31st, 2026
Retire um olho de um modelo murino com barreira retiniana comprometida, previamente injetado com vírus adeno-associado carregando o gene da proteína verde fluorescente.
A barreira retiniana comprometida permite que o AAV penetre nas células fotorreceptoras, onde o genoma viral é expresso para produzir GFP, tornando as células fluorescentes.
Disseque o olho para remover a córnea e o cristalino, mantendo a cúpula ocular intacta.
Imersa o copo escleral em uma solução fixadora para preservar a estrutura da retina.
Transfira a escova ocular sequencialmente através de concentrações crescentes de soluções crioprotetoras. Posteriormente, incube na concentração final para prevenir a formação de cristais de gelo.
Incorpore o copo ocular em meio criogênico e congele-o.
Usando um criostato, seccione o fundo do olho em fatias finas.
Monte a seção em uma lâmina. Adicione um tampão contendo detergentes para permeabilizar o tecido e permitir o acesso do anticorpo durante a imunomarcação subsequente.
Enxágue a seção. Trate-a com uma solução bloqueadora para prevenir interações inespecíficas de anticorpos durante a imunomarcação.
A crioseção da retina está pronta para procedimentos adicionais de imunomarcação e imagem de fluorescência. Células fluorescentes positivas para GFP revelam transdução viral bem-sucedida, indicando permeabilidade retiniana.
Após coletar os olhos de um animal injetado e eutanasiado, dissecar os olhos para remover a lente e a córnea. Em seguida, fixar por imersão o olho dissecado em paraformaldeído a 4% durante uma hora. Após uma hora, crioproteger os olhos em sacarose a 10% por mais uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, mergulhar os olhos em sacarose a 20% por um terço de hora à temperatura ambiente.
Por fim, deixe os olhos em solução de sacarose a 30% durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, incorpore e congele as cúpulas esclerais em uma resina de inclusão, como o cryo matrix. Em seguida, utilizando o criostato, faça cortes de 10 mícrons e monte-os em lâminas preparadas para tecidos congelados.
Agora permeabilize as seções nos lâminas com detergente durante cinco minutos. Siga com duas lavagens breves em PBS. Em seguida, bloquee os olhos por uma hora à temperatura ambiente.