Preparação de Crioseções Retinianas de Camundongo para Avaliar a Permeabilidade Retiniana ao Vírus Adenoassociado

Retire um olho de um modelo murino com barreira retiniana comprometida, previamente injetado com vírus adeno-associado carregando o gene da proteína verde fluorescente.

A barreira retiniana comprometida permite que o AAV penetre nas células fotorreceptoras, onde o genoma viral é expresso para produzir GFP, tornando as células fluorescentes.

Disseque o olho para remover a córnea e o cristalino, mantendo a cúpula ocular intacta.

Imersa o copo escleral em uma solução fixadora para preservar a estrutura da retina.

Transfira a escova ocular sequencialmente através de concentrações crescentes de soluções crioprotetoras. Posteriormente, incube na concentração final para prevenir a formação de cristais de gelo.

Incorpore o copo ocular em meio criogênico e congele-o.

Usando um criostato, seccione o fundo do olho em fatias finas.

Monte a seção em uma lâmina. Adicione um tampão contendo detergentes para permeabilizar o tecido e permitir o acesso do anticorpo durante a imunomarcação subsequente.

Enxágue a seção. Trate-a com uma solução bloqueadora para prevenir interações inespecíficas de anticorpos durante a imunomarcação.

A crioseção da retina está pronta para procedimentos adicionais de imunomarcaçã