JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 2:24 min • August 31st, 2026
Inicie com o olho de um camundongo transgênico previamente injetado com um vírus adeno-associado (AAV) contendo o gene de interesse que codifica uma proteína fluorescente.
O camundongo carece de um gene essencial para manter a integridade da membrana limitante interna (ILM), uma barreira que separa a retina da cavidade vítrea.
A perda desse gene simula a degeneração retiniana, permitindo que o vírus penetre mais profundamente nas camadas celulares da retina.
Células retinianas infectadas expressam o gene de interesse, produzindo proteínas fluorescentes, o que as torna fluorescentes.
Agora, dissecar o olho e remover a córnea e o cristalino.
Remova cuidadosamente a retina do epitélio pigmentado da retina (RPE) e da esclera, a camada externa do olho.
Imersa o tecido no fixador.
Lave com tampão fosfato para remover o fixador residual.
Quando observado em um microscópio confocal, a fluorescência nas células retinianas indica penetração viral bem-sucedida através da membrana limitante interna comprometida.
Para montagens planas da retina, facilite a dissecação fixando os olhos enucleados em paraformaldeído a 4% por 15 a 30 minutos. Essa fixação e a fixação após a dissecação devem ser realizadas corretamente, pois são fundamentais para preservar a fluorescência da GFP. Dentro de 15 a 30 minutos do período de fixação, dissecar os olhos, remover a córnea e o cristalino.
Separar a retina do epitélio pigmentado da retina e da esclera cortando ao redor da ora serrata e do nervo óptico. Após a dissecção, imergir as retinas em paraformaldeído a 4% por mais 30 minutos para fixar o tecido e a proteína fluorescente nas células retinianas transduzidas. Após a fixação, lavar o espécime por cinco minutos em PBS estéril com pH 7,4.