JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 3:24 min • August 31st, 2026
Retire tubos contendo capsídeos virais, que são partículas semelhantes a vírus sem material genético.
Aqueça os tubos a uma temperatura constante por durações variadas.
Uma duração menor de aquecimento estressa levemente as proteínas do capsídeo, enquanto o aquecimento prolongado rompe o capsídeo e causa agregação.
Resfrie rapidamente os tubos para evitar alterações estruturais adicionais.
Transfira o líquido para uma película de parafina.
Coloque uma grade de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) sobre a gota. Os capsídeos aderem à superfície da grade.
Enxugue a grade com um papel-filtro para remover o excesso de fluido.
Lave com um tampão para remover os capsídeos fracamente ligados, em seguida, seque a grade novamente.
Mergulhe no acetato de uranila, um corante de metal pesado que se liga à superfície do capsídeo, fazendo com que eles apareçam mais escuros ao microscópio eletrônico de transmissão (TEM).
Enxugue a grade e coloque-a sobre uma placa. Armazene a placa em um dessecador para remover a umidade.
Image o grade usando MET para visualizar os danos no capsídeo induzidos pelo calor.
Realize o tratamento térmico como anteriormente, substituindo o PBS por HEPES 10 milimolar, pH 7,4, e não dilua mais os capsídeos após o tratamento. Em seguida, pipete todo o volume de 15 microlitros da solução de capsídeo tratado sobre a película de parafina. Segure a borda da grade com pinças, permitindo que fechem sobre a borda para segurar a grade, e posicione a grade com o lado de carbono voltado para baixo sobre a gota da solução tratada.
Deixe o suporte incubado por 10 minutos para permitir que o capsídeo se ligue ao suporte. Dependendo da pureza da preparação do capsídeo, adicione lavagens da solução de HEPES na forma de gotas de 10 a 15 microlitros colocadas em sequência após a gota de capsídeo tratado. Após 10 minutos, pegue o suporte com a gota.
Coloque a grade quase perpendicularmente a um pedaço de papel-filtro para absorver a gota. Em seguida, use a grade para pegar a gota de 10 a 15 microlitros de tampão HEPES e mantenha por 30 segundos. Após 30 segundos de tempo de lavagem, absorva com outro pedaço de papel-filtro.
Em seguida, coloque uma gota de 15 microlitros de solução a dois por cento de acetato de uranila sobre a película de parafina em uma área vazia. Recolha a gota de acetato de uranila com a grade e mantenha por 45 segundos. Em seguida, remova o acetato de uranila, certificando-se de eliminar a maior parte da solução.
Coloque a grade com o lado de carbono voltado para cima sobre um pedaço de papel-filtro, tomando cuidado para que a grade não adere à umidade nas pinças. Em seguida, coloque o papel-filtro com a grade em uma placa de Petri de vidro aberta. Após repetir este processo para todos os tratamentos, coloque as metades das placas de Petri com as grades em um dessecador durante a noite para secagem antes da observação com MET.