JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 2:28 min • August 31st, 2026
Retire uma cultura de bactérias espiroquetas geneticamente modificadas. Essas bactérias portam o gene de resistência à gentamicina.
Adicione uma suspensão de bacteriófago ao cultivo bacteriano.
Os fagos carregam DNA plasmidial que codifica um gene de resistência à canamicina.
Incube a mistura.
O bacteriófago adere à superfície bacteriana e injeta o DNA na célula.
O plasmídeo replica-se independentemente e é transmitido quando as bactérias se dividem.
Misture a cultura incubada com um meio de agarose fundido suplementado com os antibióticos gentamicina e canamicina.
Despeje a mistura em uma placa. Deixe solidificar e, em seguida, incube.
Sob seleção com duplo antibiótico, apenas as células que carregam ambos os marcadores de resistência crescem e formam colônias, enquanto as demais células morrem.
Escolha uma colônia e inocule em um meio contendo ambos os antibióticos.
Incubar para facilitar o crescimento de bactérias com o plasmídeo transduzido para análises downstream adicionais.
Decante o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 14,5 mililitros de BSK fresco. Adicione menos de ou igual a 500 microlitros da amostra de fago precipitado com PEG à cultura do clone receptor.
Após misturar bem, incubar a 33 graus Celsius por 72 a 96 horas. Realize a seleção de transdutantes por plaqueamento em fase sólida após a mistura com fago precipitado com PEG, conforme descrito no manuscrito. Dependendo do background do clone receptor, verifique se as colônias aparecem dentro do agarose nas placas de seleção após 10 a 21 dias de incubação.
Selecione pelo menos 5 a 10 colônias que crescem no ágar na presença de ambos os antibióticos utilizando uma pipeta de borossilicato esterilizada de 5,75 polegadas com tampão de algodão e inócule-as em 1,5 mililitro de BSK com o antibiótico apropriado.