Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 2:30 min. • August 31st, 2026
Inicie com organoides intestinais de camundongo que foram parcialmente dissociados para facilitar a transdução lentiviral.
Utilize os vetores lentivirais em um meio de transdução.
O lentivírus carrega um gene de interesse para integração estável no genoma do hospedeiro.
Adicione o lentivírus ao poço.
Incube a mistura para permitir a entrada viral.
O RNA viral é transcrito reversamente em DNA e integra-se ao genoma do hospedeiro.
Adicione meio de organoides e transfira a mistura para um tubo.
Centrifugar para remover quaisquer vírus não ligados.
Misture o pellet em uma matriz da membrana basal.
Coloque os organoides em um poço e permita que solidifiquem.
A matriz forma uma rede que aprisiona os organoides e fornece suporte estrutural.
Adicione meio de organoides suplementado com promotores de crescimento para apoiar a proliferação dos organoides.
Isso resulta em organoides brotantes contendo o gene transduzido, que podem ser utilizados para análises funcionais adicionais.
Transfira os organoides nesta última pequena quantidade de meio para um poço em uma placa de 48 poços.
Adicione o lentivírus de alto título previamente preparado no meio de transdução aos organoides e ressuspenda. Incube a mistura de organoides e vírus por uma hora a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura para permitir a transdução. Após uma hora, adicione um mililitro de meio de cultura de organoides à mistura de organoides e vírus, ressuspenda e transfira a mistura para um tubo de microcentrífuga. Centrifugue a 850 ×g por cinco minutos.
Para obter o pellet dos organoides, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 20 microlitros de Matrigel gelado. Coloque a gota no centro de um poço. Em uma placa de 48 poços, incube a 37 graus Celsius por 15 minutos para que a gota solidifique. Após 15 minutos, adicione cuidadosamente 250 microlitros de meio de cultura de organoides suplementado com nicotinamida e inibidores de quinase.