JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 2:40 min • August 31st, 2026
Obtenha culturas de células de câncer de mama.
Coinfete com dois tipos de adenovírus. Um deles carrega um gene de proteína verde fluorescente ou GFP sob um promotor constitutivamente ativo.
O outro contém um gene repórter que codifica a proteína fluorescente vermelha ou RFP, sob um promotor responsivo a SMAD.
À cultura de teste, adicione TGF-beta e incube.
Os vírus se ligam ao receptor para entrar na célula hospedeira, entregar os genes ao núcleo e permitir a expressão de GFP.
Nas células-teste, o TGF-beta liga-se ao seu receptor e ativa a via SMAD por meio da fosforilação das proteínas SMAD2 e SMAD3.
Essas proteínas formam um complexo com SMAD4.
Esse complexo se liga ao promotor do gene repórter, permitindo a expressão de RFP além da GFP.
No controle, a via SMAD permanece inativa, permitindo que as células expressem apenas GFP.
Capture imagens fluorescentes de células vivas.
A presença de ambos os sinais confirma a ativação da via SMAD utilizando transdução dual por adenovírus.
No dia da infecção com adenovírus, semeie as placas de um poço de 12 com aproximadamente 1,25 vezes 10 à quinta células MDA-MB-231 em 500 microlitros de meio para uma confluência de 35%. Infete as células em todos os poços com 75 microlitros de adenovírus-CMV-GFP e 7,5 microlitros de adenovírus CAGA12-Td-Tomate para obter um MOI de 2.500, o que pode alcançar 100% de positividade de infecção. Em seguida, adicione TGF-beta ao poço de tratamento imediatamente após a infecção com adenovírus.
Incubar a 37 graus Celsius com 10% de dióxido de carbono por 24 horas. No dia seguinte, imaginar células vivas com um microscópio de fluorescência de contraste de fase.