Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 2:36 min. • August 31st, 2026
Inicie com linfócitos humanos infectados com HIV-1 em uma lamínula montada sobre uma lâmina.
Essas células foram hibridizadas com sondas que marcam fluorescentemente o RNA viral e o DNA proviral.
Incube as células em uma solução bloqueadora para evitar ligação inespecífica de anticorpos.
Introduza anticorpos primários direcionados à proteína da cápside do HIV-1.
Incubar para permitir que os anticorpos primários se liguem à proteína do capsídeo.
Lave as células com tampão para remover anticorpos não ligados.
Adicione anticorpos secundários marcados com fluoróforo que se ligam aos anticorpos primários.
Lave os anticorpos não ligados.
Adicione um corante específico para DNA para corar os núcleos das células, depois lave para remover o corante em excesso.
Utilize imagens de fluorescência multiplexadas para detectar simultaneamente DNA viral, RNA, proteína e núcleos hospedeiros em cores distintas.
Essa visualização em nível de célula única permite o estudo de diferentes estágios do ciclo de vida viral por meio da visualização simultânea de DNA, RNA e proteínas virais em células infectadas.
Para a imunomarcação das proteínas de interesse, após a última lavagem, trate cada lamínula com 200 microlitros de tampão bloqueador por uma incubação de uma hora à temperatura ambiente.
No final da incubação, despreze o tampão bloqueador e adicione 200 microlitros do anticorpo primário de interesse diluído em PBS com Tween 20 suplementado com 1% de albúmina sérica bovina. Após uma incubação de uma hora à temperatura ambiente, lave as lâminas com duas lavagens de 10 minutos em PBS fresco com Tween 20, com agitação a cada lavagem, antes de rotular as amostras com um anticorpo secundário apropriado por uma hora à temperatura ambiente. Ao final da incubação, lave as lâminas duas vezes com PBS fresco com Tween 20 por 10 minutos com agitação a cada lavagem.
Após a segunda lavagem, contra-estaine os núcleos com um corante nuclear apropriado por um minuto à temperatura ambiente, seguido por duas lavagens em PBS por 10 minutos à temperatura ambiente com agitação.