Purificação de Intassomos do Vírus Espumoso Protótipo por Cromatografia de Exclusão Molecular

Inicie com uma suspensão contendo precipitados de intassomos do vírus foamy protótipo ou PFV, integrases monoméricas, oligômeros de DNA e agregados proteicos.

Os intassomos do PFV são tetraes de integrases virais complexados com oligômeros sintéticos que mimetizam o DNA genômico viral.

Adicione uma solução salina à suspensão e incube no gelo. O sal reduz a interação eletrostática entre os intassomos, permitindo que os precipitados se solubilizem.

Pipete suavemente em intervalos regulares para promover a solubilização do intassomo.

Centrifugue para formar o pellet do precipitado remanescente e colete o sobrenadante contendo os intassomos solúveis.

Utilize uma coluna de cromatografia de exclusão por tamanho previamente equilibrada, recheada com esferas de agarose reticulada, e aplique o sobrenadante na coluna.

Devido ao seu grande tamanho, agregados proteicos e intassomos contornam os poros das esferas e eluem mais cedo.

Integrases monoméricas menores e oligômeros entram nos poros das esferas e eluem mais tarde.

Colete as frações eluídas precocemente contendo intassomos para análises downstream adicionais.

Prepare duas ponteiras de pipeta de grande diâmetro removendo dois a quatro milímetros da extremidade de uma ponteira de 200 microlitros com uma lâmina nova de bisturi ou barbeador sobre uma superfície limpa. Remova o tubo de diálise do tampão de diálise. Para evitar a diluição da amostra de intassomo com tampão de diálise que possa permanecer na extremidade do tubo próximo ao clipe, utilize uma micropipeta com uma ponteira pequena para remover qualquer excesso de tampão de diálise.

Remova o clipe desta extremidade do tubo de diálise. Ao recuperar o conjunto, é importante coletar o máximo possível da solução e do precipitado. Use a ponteira de grande diâmetro para transferir a amostra, incluindo o precipitado, dentro do tubo de diálise, para um tubo de 1,5 mililitro em gelo.

Observe o volume total do material recuperado. O volume total é tipicamente aproximadamente 140 microlitros. A amostra com precipitado está a 200 milimolar de cloreto de sódio.

Aumente o sal para uma concentração final de 320 milimolar de cloreto de sódio, adicionando o volume apropriado de uma solução estoque de cinco molar de cloreto de sódio. Transfira o balde de gelo com a amostra para uma câmara fria a quatro graus Celsius. Use a ponteira de grande diâmetro para ressuspender e solubilizar o precipitado por pipetagem.

Repita a cada 20 minutos por pelo menos uma hora. A maior parte do precipitado deve ir para a solução. Para purificar o intassomo, equilibre uma coluna de cromatografia de exclusão por tamanho em agarose reticulada ou coluna SEC com tampão de corrida SEC a uma vazão de 0,4 mililitros por minuto.

Centrifugue a amostra de intassoma em um microcentrífuga a 14.000 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius para formar um precipitado com qualquer material remanescente. Após a remoção cuidadosa do sobrenadante, carregue-o em um loop de injeção de 200 µL. Aplique a amostra na coluna de CLS.

Elua com 25 mililitros de tampão de corrida SEC e colete 95 frações de 270 microlitros. Observe que o cromatograma SEC exibe três picos de A280 e A260.