Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 2:23 min. • August 31st, 2026
Inicie com uma solução padrão de RNA viral sintetizado e diluído em série no meio de cultura.
Essas diluições servem como padrões de referência para quantificar o RNA viral nas amostras.
Agora, retire o sobrenatante contendo o vírus do cultivo celular infectado pelo vírus.
Este meio de cultura contém um inibidor que se liga a enzimas que degradam o RNA e impede a degradação do RNA viral.
Adicione o tampão de processamento contendo a enzima proteinase K.
Centrifugue brevemente a solução para uma mistura uniforme.
Coloque a placa de PCR contendo as amostras no termociclador.
Primeiro, incubar em uma temperatura moderada para ativar a proteinase K.
Essa enzima digere as proteínas virais que encapsulam o genoma, liberando o RNA viral na solução.
Em seguida, incubar a uma temperatura mais alta para inativar a enzima e desnaturar o RNA.
Finalmente, armazene as amostras processadas sob condições frias até a análise de PCR quantitativa em tempo real.
Primeiro, misture 199 microlitros de tampão de processamento com um microlitro de proteinase K livre de nucleases. Usando meio de cultura celular, dilua seriamente o RNA da região UTR 3' do vírus da dengue preparado na proporção de 1:10 para obter padrões de RNA em concentrações variando de 5.000.000 a 5.000 cópias por microlitro, repetindo a pipetagem e a vortexagem. Transfira 5 microlitros do sobrenadante da cultura de células infectadas com o vírus da dengue e do padrão de RNA da região UTR 3' do vírus da dengue para tiras PCR A2 ou para os poços de uma placa PCR de 96 poços.
Misture cinco microlitros da solução contendo tampão de processamento e proteinase K. Centrifugue brevemente a 200 × g por cinco segundos. Incube as amostras em um termociclador a 25 graus Celsius por dez minutos e, em seguida, a 75 graus Celsius por cinco minutos.