Obtenção de RNA Viral para Análise por Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real (qPCR)

Inicie com uma solução padrão de RNA viral sintetizado e diluído em série no meio de cultura.

Essas diluições servem como padrões de referência para quantificar o RNA viral nas amostras.

Agora, retire o sobrenatante contendo o vírus do cultivo celular infectado pelo vírus.

Este meio de cultura contém um inibidor que se liga a enzimas que degradam o RNA e impede a degradação do RNA viral.

Adicione o tampão de processamento contendo a enzima proteinase K.

Centrifugue brevemente a solução para uma mistura uniforme.

Coloque a placa de PCR contendo as amostras no termociclador.

Primeiro, incubar em uma temperatura moderada para ativar a proteinase K.

Essa enzima digere as proteínas virais que encapsulam o genoma, liberando o RNA viral na solução.

Em seguida, incubar a uma temperatura mais alta para inativar a enzima e desnaturar o RNA.

Finalmente, armazene as amostras processadas sob condições frias até a análise de PCR quantitativa em tempo real.

Primeiro, misture 199 microlitros de tampão de processamento com um microlitro de proteinase K livre de nucleases. Usando meio de cultura celular, dilua seriamente o RNA da região UTR 3' do vírus da dengue preparado na proporção de 1:10 para obter padrõe