Coleta de Partículas do Vírus da Hepatite E de Células de Câncer Hepático Humano

Inicie com um cultivo de células de câncer hepático humano transfectadas com RNA do vírus da hepatite E (HEV) para produção de partículas virais.

Alguns VHEs adquirem uma membrana endossomal de origem hospedeira e saem da célula, enquanto outros permanecem dentro da célula como VHEs não envelopados.

Para colher HEV extracelular, colete e filtre o sobrenadante do cultivo para remover detritos celulares.

Armazene em temperatura ultra-baixa para preservar a infectividade.

Para colher HEV intracelular, lave as células com um tampão.

Adicione tripsina-EDTA para destacar as células e, em seguida, adicione meio para interromper a atividade enzimática.

Transfira a suspensão para um tubo e centrifugue.

Descarte o sobrenadante contendo tripsina residual. Re-suspenda o pellet e transfira-o para um tubo.

Congele as células em nitrogênio líquido e descongele-as sobre gelo.

Repita os ciclos de congelamento-descongelamento para lisar as células, liberando os vírus.

Centrifugue, colete o sobrenadante contendo os vírus e armazene em temperatura ultra-baixa.

No sexto dia, filtre o sobrenadante através de uma malha de 0,45 micrômetros para remover qualquer debris celular e armazene o vírus da hepatite E derivado de cultura celular extracelular colhido a quatro graus Celsius. Para a colheita de partículas virais intracelulares derivadas de cultura celular do vírus da hepatite E, lave as células com PBS e desprenda as células com 1,5 mililitros de tripsina-EDTA 0,05% a 37 graus Celsius. Quando as células tiverem se despreendido, interrompa a reação com 8,5 mililitros de DMEM e transfira a suspensão celular para um tubo de 50 mililitros para centrifugação.

Adicione 1,6 mililitro de meio completo DMEM por eletroporação em tubos de reação individuais de dois mililitros e use 800 microlitros do meio para ressuspender as células, transferindo assim as células para os tubos. Congele as células em nitrogênio líquido e, posteriormente, descongele as células em gelo três vezes antes de centrifugar os lisados resultantes em alta velocidade por 10 minutos a 10.000 × g. Em seguida, transfira os sobrenadantes para novos tubos sem perturbar os pellets de detritos celulares para armazenamento a menos 80 graus Celsius.