Purificação de Vírus do Fluido Alantoide de Ovos de Galinha Embrionados

Inicie com um reservatório contendo fluido alantoico coletado de ovos de galinha infectados com o vírus.

Este fluido contém partículas virais juntamente com contaminantes derivados do hospedeiro.

Passe o fluido por um filtro de profundidade para capturar contaminantes grandes, permitindo que contaminantes menores e vírus passem através.

Em seguida, carregue o fluido filtrado em um sistema de filtração, onde ele flui tangencialmente sobre uma superfície de membrana.

Contaminantes menores passam através da membrana, enquanto o vírus é retido e concentrado.

Carregue o vírus concentrado em um gradiente de densidade e centrifugue-o. O vírus forma uma banda distinta onde sua densidade corresponde à do gradiente.

Colete a faixa rica em vírus em uma cassete de diálise e coloque-a em um tampão. Os componentes do gradiente difundem-se para fora, enquanto a água do tampão difunde-se para dentro através da membrana semipermeável.

Em seguida, coloque a cassete em uma solução hipertônica para retirar a água e concentrar o vírus purificado.

Para a purificação do vírus da doença de Newcastle ou NDV, primeiramente, prepare o sistema experimental previamente montado passando 50 mililitros de PBS através dele.

Interrompa a bomba quando restarem aproximadamente cinco mililitros de PBS no tubo. Em seguida, acople um filtro de profundidade com classificação de retenção de um a três micrômetros ao tubo. Para ventilar o filtro, remova a segunda tampa do lado apical do filtro de profundidade e, então, inicie a passagem de mais 50 mililitros de PBS pelo sistema.

Uma vez que o PBS comece a fluir através da ventilação na parte superior do filtro, feche a porta e continue a passar PBS pelas linhas. Em seguida, substitua o recipiente de descarte por um novo recipiente estéril de coleta e inicie a passagem do fluido alantoico pelo filtro de profundidade. Depois, monte o sistema de filtração de fluxo tangencial ou sistema TFF em uma configuração aberta e opere conforme descrito no manuscrito.

Quando restarem cerca de cinco mililitros de fluido no reservatório, pause a bomba e adicione fluido alantoico filtrado em profundidade ao reservatório. Em seguida, reinicie o fluxo da bomba. Para evitar a cisalhamento do vírus, é importante garantir que a pressão do sistema não exceda 10 libras-força por polegada quadrada.

Para aumentar a eluição, deve-se usar uma combinação da velocidade da bomba peristáltica e do grampo em C. Deixe 150 a 100 mililitros de fluido alantoico no reservatório, pare a bomba e troque o tampão adicionando 150 a 200 mililitros de tampão ML. Novamente, pare a bomba quando restarem de cinco a dez mililitros de fluido no reservatório, então use dois grampos em C para fechar as linhas de descarte.

Desconecte a linha de retenção que alimenta o reservatório e insira-a em um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, retome o fluxo e pause quando restarem apenas algumas gotas de fluido no tanque do reservatório. A seguir, remova os grampos em C das linhas de desperdício e reconecte a linha de alimentação de retenção ao tanque do reservatório.

Enquanto isso, para preparar a ultracentrifugação em gradiente de densidade de iodixanol, adicione primeiro 0,5 mililitros de iodixanol a 40% a um tubo de ultracentrífuga de parede fina com topo aberto de 13,2 mililitros. Em seguida, prepare a coluna com adições sucessivas de 2,5 mililitros de iodixanol a 20% e 2,5 mililitros de iodixanol a 10%. Antes da ultracentrifugação, adicione cuidadosamente de seis a 6,5 mililitros da solução viral eluída do sistema TFF à coluna de iodixanol sem perturbar o gradiente.

Após a ultracentrifugação, remova os tubos com um par de pinças estéreis. A banda alvo deve ser uma banda ampla entre os gradientes de 10 e 20%. Em seguida, suspenda o tubo sobre a parte superior de um béquer utilizando um suporte com haste.

Em seguida, acople uma agulha de 18 gauge e 1,5 polegada a uma seringa de cinco mililitros, fure a lateral do tubo de ultracentrifugação com a agulha e remova a banda alvo ao estender lentamente o êmbolo. Após remover o iodixanol da solução viral conforme descrito no manuscrito, utilize uma seringa para injetar cuidadosamente o vírus em uma cassete de diálise. Para concentrar a solução viral, retire a cassete de diálise do tampão de diálise e coloque-a em um pequeno saco plástico vedável.

Em seguida, adicione 15 a 25 mililitros de polietilenoglicol 40% ao saco, de modo que a cassete de diálise fique completamente submersa.