Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 4:46 min. • August 31st, 2026
Retire uma cultura de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs).
Adicione o vírus Sendai que codifica fatores de transcrição de reprogramação. Cubra e feche a placa.
Centrifugue para aumentar o contato entre o vírus e a célula e incube.
Após a fusão do vírus, o RNA viral expressa fatores de transcrição que ativam genes de pluripotência celular e reprimem genes específicos de linhagem para iniciar o reprogramamento.
Neste período, um subconjunto de PBMCs transduzidos converte-se em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) e expressa proteínas de adesão.
Transfira-os para um poço revestido com matriz e centrifugue as células. Substitua o sobrenatante por um meio de crescimento.
Após a incubação, as iPSCs aderem à matriz, enquanto os PBMCs transduzidos não aderentes permanecem em suspensão.
Transfira a suspensão para um poço revestido e centrifugue. Adicione o meio ao poço original e incube ambos.
Os PBMCs transduzidos remanescentes iniciam o reprogramamento, convertem-se em iPSCs e aderem. Este passo maximiza a retenção de células reprogramadas.
Substitua o meio diariamente para sustentar o crescimento de iPSCs.
Neste procedimento, transfira as células sanguíneas para um tubo cônico de 15 mililitros e conte-as utilizando um hemocitômetro. Em seguida, prepare três vezes dez à quinta potência de células para transdução e centrifugue as células a 515 × g durante cinco minutos à temperatura ambiente.
Posteriormente, descarte o sobrenadante por sucção e ressuspenda as células em 0,5 mililitros de meio para células sanguíneas. Em seguida, transfira as células para um poço de uma placa de 24 poços não revestida. Deixe o vírus Sendai descongelar no gelo e adicione-o às células suspensas.
Selar a placa com uma película vedante e centrifugar a 1.150 × g durante 30 minutos a 30 °C. Após a centrifugação, incubar as células a 37 °C em 5% de CO₂ durante a noite. No dia seguinte, para revestir uma placa de 24 poços com vitronectina, diluir a solução de vitronectina em PBS para obter uma concentração final de 5 µg/mL.
Em seguida, adicione um mililitro de vitronectina a um poço e incube-o à temperatura ambiente por pelo menos uma hora. Após esse período, remova a solução de revestimento e transfira todo o meio contendo as células e o vírus para o poço revestido. Em seguida, colete as células remanescentes com um volume adicional de 0,5 mililitros de meio fresco para células sanguíneas e adicione-o ao poço que contém as células.
Posteriormente, centrifugue a placa a 1.150 × g durante dez minutos a 35 °C e, em seguida, mantenha as células a 37 °C em 5% de CO₂ durante a noite. Para a segunda transferência celular, revista o poço com vitronectina a 5 µg/mL, conforme descrito anteriormente. Utilize um poço da placa para cada transdução e transfira a suspensão celular da primeira placa para a placa recém-revestida com vitronectina.
Enquanto isso, adicione um mililitro de meio para iPSC a um poço da primeira placa para manutenção e incube a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono, com troca diária do meio por meio fresco para iPSC. Colônias aparecerão entre o dia 14 e 21 após a transdução. Centrifugue a placa recém-revestida, contendo as células suspensas, a 1.150 × g e 35 graus Celsius por dez minutos.
Após a centrifugação, incubar as células a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono, durante a noite. No dia seguinte, remover o sobrenadante e substituí-lo por meio fresco de células-tronco pluripotentes induzidas. Manter as células aderidas com troca diária de meio, até que se atinja 80% de confluência.