JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 3:41 min • August 31st, 2026
Inicie com tubos contendo células epiteliais pulmonares humanas.
Adicione vírus da influenza biotinilados e incube no gelo. Os vírus se ligam à superfície celular sem serem internalizados.
Centrifugue para separar as células ligadas ao vírus, remova o sobrenadante e ressuspenda.
No tubo do ponto temporal inicial, adicione estreptavidina não marcada, que se liga aos vírus biotinilados, formando complexos.
Adicione estreptavidina marcada com fluoróforo, que não consegue ligar-se ao complexo vírus estreptavidina-biotina. Lave e fixe as células.
Incube o tubo do ponto de tempo posterior em uma temperatura mais alta, permitindo a internalização do vírus, e depois retorne à gelo.
Adicione estreptavidina não marcada e um agente bloqueador de internalização, que impede a captação viral adicional, e incube. A estreptavidina liga-se aos vírus biotinilados ligados à superfície, depois lave.
Fixe as células e adicione um tampão contendo detergente para permeabilizá-las.
Lave e adicione estreptavidina marcada com fluoróforo, que entra nas células e se liga à biotina.
Analise as amostras por citometria de fluxo.
Uma maior fluorescência no ponto de tempo posterior confirma a internalização viral bem-sucedida.
Após repetir a lavagem mais uma vez, resfrie os tubos no gelo por 10 minutos. Quando os tubos estiverem resfriados, centrifugue novamente e use 100 microlitros de vírus biotinilado diluído em PBS de infecção para ressuspender os pellets após incubação no gelo por uma hora; repita a centrifugação e lave com PBS duas vezes, processando as amostras seguintes em paralelo, tanto quanto possível, para as amostras de zero minuto.
Para tratar as amostras do tempo zero mais STV, centrifugue os tubos, remova o sobrenadante e use 15 microlitros de STV com 2% de BSA e 0,1% de azida de sódio em PBS para ressuspender o pellet celular. Incube no gelo por 30 minutos. Em seguida, centrifugue e use PBS para lavar as células duas vezes após a fixação com PFA conforme demonstrado anteriormente, e armazene as amostras a quatro graus Celsius.
Para as amostras de mais de 30 minutos com STV. Após a centrifugação, reconstitua as amostras em 200 microlitros de PBS com 2% de BSA, seguindo um período de incubação a 37 graus Celsius por 30 minutos.
Centrifugue e ressuspender as células em 50 microlitros de STV com 2% de BSA e 0,1% de azida de sódio em PBS, incubar no gelo por 30 minutos antes de lavar e fixar. Em seguida, após a permeabilização e coloração de todas as amostras com STV-Cy3, conforme descrito no protocolo textual, armazenar as amostras a quatro graus Celsius. Por fim, analisar as amostras por citometria de fluxo.