Análise da Internalização do Vírus Influenza Utilizando um Ensaio de Bloqueio com Estreptavidina

Inicie com tubos contendo células epiteliais pulmonares humanas.

Adicione vírus da influenza biotinilados e incube no gelo. Os vírus se ligam à superfície celular sem serem internalizados.

Centrifugue para separar as células ligadas ao vírus, remova o sobrenadante e ressuspenda.

No tubo do ponto temporal inicial, adicione estreptavidina não marcada, que se liga aos vírus biotinilados, formando complexos.

Adicione estreptavidina marcada com fluoróforo, que não consegue ligar-se ao complexo vírus estreptavidina-biotina. Lave e fixe as células.

Incube o tubo do ponto de tempo posterior em uma temperatura mais alta, permitindo a internalização do vírus, e depois retorne à gelo.

Adicione estreptavidina não marcada e um agente bloqueador de internalização, que impede a captação viral adicional, e incube. A estreptavidina liga-se aos vírus biotinilados ligados à superfície, depois lave.

Fixe as células e adicione um tampão contendo detergente para permeabilizá-las.

Lave e adicione estreptavidina marcada com fluoróforo, que entra nas células e se liga à biotina.

Analise as amostras por citometria de fluxo.

Uma maior fluorescência no ponto de tempo posterior confirma a internalização viral bem-sucedi