JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 vistas • 3:00 min • August 31st, 2026
Inicie com uma placa de múltiplas cavidades contendo uma suspensão de fago diluída em série em caldo rico em nutrientes como tratamento e caldo sem fago como controle.
Adicione E. coli a cada poço. Usando um espectrofotômetro, meça a densidade óptica (DO) inicial para registrar a concentração bacteriana inicial.
Em seguida, incube a placa para permitir o crescimento bacteriano e a infecção por fago.
No controle, as bactérias utilizam nutrientes e proliferam, aumentando a DO.
No tratamento, os fagos se ligam aos receptores da superfície bacteriana e injetam seus genomas no citoplasma.
Utilizando a maquinaria da célula hospedeira, o genoma viral se replica e produz proteínas virais, que se montam em novas partículas virais. Essas partículas lisam a célula, liberando a prole.
Meça a DO em intervalos para comparar o crescimento bacteriano.
Os poços de controle mostram um aumento progressivo na DO, enquanto os poços tratados com fagos exibem valores de DO mais baixos, com reduções maiores em concentrações mais elevadas de fagos.
Isso ajuda a determinar a concentração de fago necessária para a máxima inibição do crescimento bacteriano.
Para começar, monte o ensaio em microplaca utilizando ponteiras filtradas para evitar contaminação cruzada. Primeiro, adicione 180 microlitros de mTSB nas cavidades das colunas um a 12 da microplaca de 96 poços. Em seguida, prepare diluições seriadas dez vezes de cada fago nas colunas um a oito das microplacas estéreis de 96 poços para montar o ensaio. Adicione 20 microlitros de fagos individuais ou coquetéis de fagos nas cavidades um a oito da primeira linha A da microplaca.
Para o controle sem fago e controle em branco, adicione 20 microlitros de mTSB ao poço superior das colunas nove a 12. Durante a pipetagem, misture o conteúdo dos poços com aspirações suaves e repetidas pelo menos cinco vezes, trocando as ponteiras entre as diluições. Remova 20 microlitros da última linha H e, em seguida, prepare um reservatório para a cepa bacteriana testada transferindo dois a três mililitros da cultura diluída para o reservatório usando uma pipeta de um mililitro.
Usando uma pipeta multicanal, adicione 20 microlitros da cultura bacteriana diluída a cada poço nas colunas um a 10, trocando as ponteiras entre cada adição. Cubra e incube a microplaca a 37 graus Celsius. Em intervalos de duas horas, retire a microplaca do incubador e leia a placa utilizando um leitor de microplacas.
Alternativamente, incubar a placa em um leitor de microplacas e realizá-la ao longo do tempo.