Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 2:48 min. • August 31st, 2026
Retire um cultivo celular de mamífero em fase estacionária com mínima replicação de DNA e colete o meio condicionado.
Adicione o vírus herpes simples (HSV) e incube com agitação ocasional para permitir a ligação viral. Lave para remover o vírus não ligado e restabeleça o meio condicionado.
Após a incubação, o vírus se funde com a membrana do hospedeiro, liberando o nucleocapsídeo no citoplasma.
O dsDNA viral entra no núcleo, circulariza-se e expressa proteínas virais para a replicação do DNA viral.
As proteínas virais e hospedeiras desenrolam o DNA viral e sintetizam um primer de RNA. Em seguida, o complexo da polimerase viral liga-se e alonga o primer para a síntese de DNA.
À medida que a replicação progride, adicione um análogo de nucleosídeo ao meio de cultura. Ele entra nas células e é convertido em sua forma de trifosfato.
Como a replicação do DNA do hospedeiro é mínima, o análogo é preferencialmente incorporado ao DNA viral em replicação, marcando os genomas virais.
Os genomas virais marcados estão prontos para análise proteômica downstream das proteínas associadas.
Inicie este procedimento com o cultivo de células MRC-5 conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, dilua o HSV-1 em solução salina tamponada com Tris fria ou TBS. Para as etapas seguintes, é importante desligar o exaustor e a cabine de cultura de tecidos para evitar que as células sequem.
Use uma pipeta para transferir o meio de crescimento das células MRC-5 para um frasco estéril, para ser adicionado novamente às células após a infecção. Infete as células adicionando sete mililitros do vírus diluído às células. Agite as células a cada 10 minutos durante uma hora à temperatura ambiente.
Após a adsorção, aspire o inóculo, lave as células com 50 mililitros de TBS à temperatura ambiente e substitua o meio de crescimento original. Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius na presença de 5% de dióxido de carbono. Após o início da replicação do DNA viral, por volta de quatro horas pós-infecção, marque o DNA viral em replicação.
Para fazer isso, dilua o EdC em um mililitro de meio de crescimento e adicione ao meio de cultura celular das células infectadas por duas a quatro horas.