Isolamento de Proteínas de Complexos DNA Viral-Proteína

Retire os núcleos celulares contendo genomas virais, marcados com nucleotídeos modificados com alquino.

Suspenda os núcleos em uma mistura de azida de biotina e íons de cobre, e incube.

O íon cobre auxilia na ligação covalente entre o grupo azida e o alquino.

Centrifugue e descarte o sobrenadante.

Resuspenda no tampão, transfira e centrifugue para formar o pellet.

Congele rapidamente, depois descongele o precipitado para auxiliar na lise.

Resuspenda e sonique para lisar os núcleos.

Centrifugue e colete o sobrenadante contendo os complexos proteína-DNA viral.

Filtre o sobrenadante para remover contaminantes.

Dilua o filtrado.

Adicione as esferas magnéticas revestidas com estreptavidina e incube para facilitar a ligação com os complexos proteína-DNA biotinilados.

Aplique um campo magnético para coletar as esferas e lave para remover contaminantes.

Repita a lavagem.

Adicione um tampão de eluição e aqueça para separar e desnaturar as proteínas.

Separe as esferas, colete o eluato.

Congele rapidamente as proteínas isoladas. Armazene em temperaturas ultra-baixas para análises posteriores.

Após remover completamente o PBS, re-suspenda o pellet nuclear em 10 mililitros da mistura de reação de click, pipetando suavemente para cima e para baixo cinco vezes com uma pipeta de 10 mililitros. Incube a amostra sob rotação por uma hora a quatro graus Celsius, antes de centrifugar os núcleos como anteriormente.

Remova completamente a mistura da reação de click, em seguida, lave o pellet re-suspendendo-o suavemente em 10 mililitros de PBS e centrifugando novamente. Agora, re-suspenda cuidadosamente o pellet nuclear em um mililitro de PBS e transfira a solução para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro. Após a centrifugação, remova completamente o PBS e congele rapidamente o pellet em nitrogênio líquido.

Neste ponto, o pellet pode ser armazenado a 80 graus Celsius ou o procedimento pode ser continuado. Para lisar os núcleos e fragmentar o DNA, re-suspenda os núcleos descongelados em 500 microlitros do Tampão B1 por pipetagem para cima e para baixo. Incube a suspensão em gelo por 45 minutos.

Em seguida, sonique as amostras seis vezes, durante 30 segundos cada, com amplitude de 40%, utilizando uma ponteira micrográfica de três milímetros. Coloque as amostras no gelo por pelo menos 30 segundos entre os pulsos. Após a sonicação, as amostras devem apresentar-se claras, não turvas.

Centrifugue os detritos celulares a 14.000 x G durante 10 minutos a quatro graus Celsius para formar o pellet. O tamanho do pellet deve diminuir substancialmente; filtre o sobrenadante através de um filtro celular de 100 mícrons e retenha o filtrado. Em seguida, adicione 500 microlitros de Tampão B2 ao sobrenadante filtrado.

Para ligar o DNA biotinilado às microesferas revestidas com estreptavidina, prepare as microesferas magnéticas de estreptavidina transferindo 300 microlitros da suspensão de microesferas para um tubo microcêntrifugo de 1,5 mililitro. Prepare um tubo de microesferas por amostra. Lave as microesferas três vezes com um mililitro do Tampão B2, agitando em vórtex para re-suspender, aplicando ao ímã para separar as microesferas e aspirando o tampão de lavagem.

Em seguida, adicione 900 microlitros da amostra aos beads lavados. O restante da amostra será utilizado para isolamento de DNA e proteína de entrada. Incube a suspensão durante a noite a quatro graus Celsius sob rotação.

No dia seguinte, coloque as amostras em um suporte magnético para microtubos e remova o sobrenadante. Re-suspenda suavemente as microesferas em um mililitro do Tampão B2, antes de rotacionar a quatro graus Celsius por cinco minutos. Remova novamente o sobrenadante utilizando o suporte magnético para microtubos.

Desta vez, re-suspenda suavemente as esferas em um mililitro do Tampão B3 e incube em rotação a quatro graus Celsius por cinco minutos. Após remover o sobrenatante da mistura de esferas utilizando o ímã, re-suspenda as esferas em 50 microlitros de tampão amostral 2x Laemmli para eluir os complexos de DNA-proteína. Em seguida, aqueça as amostras a 95 graus Celsius por 15 minutos.

Vortex uma mistura antes de centrifugar rapidamente as amostras em um microcentrífugo. Aplique as amostras ao ímã e transfira o eluato para um novo tubo. Por fim, congele rapidamente as amostras e armazene-as a 80 graus Celsius.

Realize a análise de proteínas conforme descrito no protocolo textual.