Um dispositivo revestido de silicone impresso em 3D para modelar a infecção do trato urinário associada ao cateter

Pegue uma placa de vários poços contendo urina humana estéril.

Inocular os alvéolos de ensaio com bactérias. Os poços de controle contêm apenas urina.

Pegue um dispositivo revestido de silicone impresso em 3D que imita a superfície interna de um cateter, onde os biofilmes se desenvolvem durante infecções urinárias associadas ao cateter.

Coloque-o nos poços, feche o prato e incuba-o.

As bactérias se ligam à superfície do dispositivo, utilizam nutrientes da urina e formam biofilmes.

Enxágue o dispositivo com um tampão para remover bactérias frouxamente ligadas.

Coloque o dispositivo em uma placa de vários poços contendo cristal violeta, que interage com o biofilme para corá-lo.

Enxágüe com água e seque.

Mergulhe o dispositivo em uma placa de vários poços contendo uma solução ácida para interromper as interações corante-biofilme e liberar o corante na solução.

Medir a absorvância das soluções em cada poço utilizando um espectrofotómetro.

A maior absorbância nos poços de teste em comparação com os poços de controle confirma a formação de biofilme no dispositivo, indicando sua adequação para modelar a infecção do trato urinário associada ao cateter.

Para começar, obtenha uma amostra de urina humana agrupada. Alíquota de 135 microlitros de urina humana acumulada em cada poço de teste de uma placa de 96 poços seguindo o layout designado.

Inocule cada poço em teste com 15 microlitros de cultura bacteriana normalizada durante a noite para atingir um volume final de 150 microlitros por poço. Reserve pelo menos 100 microlitros desta cultura para as etapas subsequentes de validação da diluição em série.

Prepare poços de controle negativo adicionando 150 microlitros de urina humana estéril acumulada em poços designados.

Agora, insira os pinos em seus poços correspondentes. Pressione a tampa do pino para baixo até que ela fique nivelada com a placa e prenda-a com a tampa da microplaca, prendendo-a com fita adesiva, se necessário.

Em seguida, coloque os modelos de pinos em uma banheira ou saco plástico lacrado contendo um rolo azul úmido para evitar a evaporação. Incubar estaticamente por 24 horas a 37 graus Celsius.

Para validação do inóculo, alíquota de 180 microlitros de PBS nas linhas 2 a 6 da primeira coluna de uma placa de 96 poços antes de adicionar a cultura reservada.

Agora, transfira 20 microlitros do primeiro poço para o segundo poço, misturando delicadamente pipetando para cima e para baixo. Continuar as diluições em série até que o inóculo inicial tenha sido diluído até ao alvéolo final.

Em seguida, coloque 10 pontos de microlitros de cada diluição em meio sólido apropriado em triplicata. Após a incubação noturna a 37 graus Celsius, conte as colônias de cada local.

Para a quantificação do biofilme, remova o modelo de pino da microplaca e inverta-o sob uma chama ou dentro de uma cabine de segurança microbiológica, com os pinos voltados para cima. Descarte as microplacas usadas.

Transfira a tampa do pino para uma microplaca nova contendo alíquotas de 180 microlitros de PBS estéril para enxaguar as células não aderidas.

Em seguida, trabalhando assepticamente, coloque um suporte de tubo de ensaio de vidro estéril na bancada e prenda a parte superior do rack que segura a tampa do pino.

Com uma micropipeta, alíquota de 600 microlitros de PBS estéril em cada tubo de ensaio. Agora, insira a tampa do pino no rack, certificando-se de que os pinos estejam alinhados com os tubos de ensaio. Remova qualquer fita de autoclave da tampa.

Use uma pinça estéril para empurrar cada pino através da tampa para os tubos de ensaio diretamente abaixo. Em seguida, substitua as tampas dos tubos de ensaio e votice cada tubo por 60 segundos para desalojar as células associadas ao biofilme.

Remova 100 microlitros de cada tubo de vórtice e execute diluições seriadas em PBS estéril como feito anteriormente.

Para corar as células com cristal violeta, pipete 180 microlitros de 0,1% em peso por volume de cristal violeta em água destilada estéril nos 24 poços em teste de uma placa de 96 poços. Insira o modelo de pino lavado nos poços correspondentes e incube em temperatura ambiente por 20 minutos.

Após a coloração, remova o modelo de pino da placa e descarte a placa usada. Em uma banheira limpa, enxágue todo o modelo de pino em água corrente da torneira com agitação suave.

Após mais 2 lavagens, inverta o modelo de pino e deixe secar completamente em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 180 microlitros de ácido acético a 30% a uma nova placa de 96 poços. Insira o modelo de pino seco nos poços correspondentes.

Quando a incubação estiver concluída, remova o modelo de pino da microplaca. Meça a densidade óptica dos poços corados em 540 nanômetros usando um leitor de microplacas ou espectrofotômetro.