Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 4:35 min. • August 31st, 2026
Inicie com células de mamífero infectadas com um adenovírus.
Realize ciclos repetidos de congelamento e descongelamento para lisar as células e liberar os vírions.
Centrifugue o lisado para formar o pellet dos detritos. Colete o sobrenadante contendo as partículas virais.
Coloque o sobrenatante viral sobre um gradiente em etapas de cloreto de césio para separação com base na densidade.
Ultracentrifugue para permitir que as partículas virais migrem de acordo com suas densidades de flutuação.
Os vírions intactos que contêm o genoma adenoviral completo são mais densos devido ao DNA empacotado e sedimentam em uma faixa mais baixa, enquanto os capsídeos vazios e detritos mais leves permanecem nas camadas superiores.
Remova as camadas superiores. Colete a faixa inferior de viriões contendo o genoma.
Re-suspenda os viriões em cloreto de césio de densidade uniforme e submeta-os novamente à ultracentrifugação para aprimorar a separação e concentrar as partículas completas.
Descarte as camadas superiores e recupere a faixa inferior.
Dialise a amostra para remover o cloreto de césio.
Os vetores adenovirais de alta pureza, contendo o genoma, estão agora prontos para aplicações posteriores.
Para preparar o lisado viral para a purificação em gradiente de cloreto de césio, congele e descongele quatro vezes a suspensão de células e vírus. Em seguida, centrifugue o lisado viral a 500 vezes g durante oito minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, colete o sobrenadante contendo o adenovírus de alta capacidade. Pipete cuidadosa e lentamente as soluções de cloreto de césio nos tubos na seguinte ordem: 0,5 mililitros da solução de 1,5 gramas por centímetro cúbico, três mililitros da solução de 1,35 gramas por centímetro cúbico e 3,5 mililitros da solução de 1,25 gramas por centímetro cúbico. Sobreponha aproximadamente 4,5 mililitros do sobrenadante do vetor clarificado sobre a camada de 1,25 gramas por centímetro cúbico.
Centrifugue os gradientes em uma ultracentrífuga usando um rotor de balanço a 12 graus Celsius por pelo menos duas horas a 226.000 × g para separar as partículas virais contendo o genoma de adenovírus de alta capacidade das partículas vazias e dos detritos celulares. Após a centrifugação, uma faixa difusa de detritos celulares forma-se na parte superior dos tubos. Abaixo dessa, podem ser observadas duas faixas brancas.
A faixa superior contém partículas vazias, enquanto a faixa inferior é o adenovírus de alta capacidade. Remova cuidadosamente as camadas de detritos celulares e partículas vazias. Em seguida, colete um mililitro das faixas inferiores de cada tubo.
Transfira o vírus para um tubo estéril de 50 mililitros. Adicione até 24 mililitros de solução de cloreto de césio a 1,35 gramas por centímetro cúbico às partículas virais coletadas e misture cuidadosamente. Complete os tubos de centrífuga com a solução de vírus em cloreto de césio a 1,35 gramas por centímetro cúbico até a borda.
Em seguida, centrifugue durante a noite a 226.000 × g a 12 graus Celsius em ultracentrífuga utilizando um rotor de braço oscilante com aceleração e desaceleração lentas. Remova as camadas superiores a partir do topo usando uma pipeta. Em seguida, colete o adenovírus de alta capacidade presente na faixa inferior proeminente utilizando uma ponteira de pipeta nova.
Por fim, realize a diálise das partículas virais coletadas para a troca de tampão. Em seguida, determine o título da preparação final de acordo com as instruções detalhadas no protocolo escrito.